Осаго пролонгация: Пролонгация полиса ОСАГО

12 января, 1970
Разное
By alexxlab

Содержание

Продлить полис ОСАГО онлайн через интернет, продление страховки Е ОСАГО

Базовый тариф. Он зависит от типа и категории транспортного средства, юридического статуса застрахованного (частное или юридическое лицо).

СК. Коэффициент сезонности. Стоимость полиса зависит от срока страхования. При оформлении ОСАГО на 1 год, коэффициент равен 1, если срок меньше, применяется корректирующий коэффициент, уменьшающий стоимость полиса.

КТ. Территориальный коэффициент. В каждом субъекте РФ установлен свой тариф, отражающий интенсивность дорожного движения и уровнем риска ДТП. Для физических лиц – это место прописки собственника транспортного средства.

КБМ. Бонус-малус. Коэффициент, который снижает стоимость полиса у водителей за безаварийную эксплуатацию машины или увеличивает при попадании в ДТП. Для расчета берутся лишь случаи, когда вина страхователя была доказана, и по ним была выплачена компенсация. Диапазон КБМ 0,5–2,45.

КО. Коэффициент из расчета количества водителей, допущенных к вождению ТС. Если количество ограничено применяется базовое значение 1, при неограниченной страховке КО составит 1,87.

КВС. Коэффициент по возрасту и стажу. Он рассчитывается исходя из возраста водителя и его стажа вождения. Учитываются все лица, которые включаются в договор. Если КВС у водителей разный, показатель рассчитывается по наихудшему значению. Если страховку оформляет водитель, не достигший 22-х лет и/или имеющий стаж до 3 лет, коэффициент максимально увеличивает стоимость полиса. Если оформляется неограниченная страховка, КВС устанавливается 1.0, который является минимальным показателем.

КМ. Коэффициент мощности автомобиля. В зависимости от мощности двигателя КМ рассчитывается в диапазоне 0,6–1,6.

КН. Коэффициент нарушений. Он отражает наличие грубых нарушений со стороны допущенных к управлению ТС водителей. Если нарушений нет, он равен 1. К грубым нарушениям относятся установленные факты попыток обмана страхователем страховой компании. Например, сообщение ложных сведений, от которых зависит стоимость полиса, умышленное содействие наступлению страхового случая. В этом случае применяется КН 1,5.

КПр. Коэффициент при управлении ТС С прицепом. В зависимости от типа и назначения транспортного средства применяется коэффициент в размере 1,0–1,4.

Стоимость страховки определяется путем умножения рассчитанных коэффициентов на базовый тариф.

Продлить полис ОСАГО от Росгосстрах

Иван Блинов Автор Выберу.ру, [email protected] Специализация: кредиты, микрозаймы, вклады, ипотека, автострахование, дебетовые и кредитные пластиковые карты

В в 2021 году вы можете продлить полис ОСАГО онлайн, через портал Выберу.ру. Заходить на официальный сайт Росгосстрах при этом не потребуется. Указанные при оформлении данные сразу же вносятся в базу РСА, а полис вы получите в течение нескольких минут на электронную почту. Мы ежедневно обновляем данные о тарифах, поэтому они всегда актуальны, однако конечная сумма зависит от страховщика. На этой же странице можно как продлить, так и впервые оформить электронный договор.

Как происходит пролонгация через интернет

Согласно законодательству РФ, договор ОСАГО заключается всегда на один год, а затем нужно обязательно продлевать полис на такой же срок. Если этого не сделано, автовладельцу назначается штраф.

Важно! Продлить страховку советуют заранее, не дожидаясь окончания текущей. Заново оформить электронный или бумажный договор страхования можно не раньше, чем за 2 месяца до окончания срока действующего.

Пролонгировать обязательную страховку через наш сайт легко. Для этого:

В форме на странице укажите данные о своем авто, его водителях (добавить нового можно через кнопку «Добавить водителя +») и действующем договоре. Не забудьте указать свои персональные данные и контакты.
Поставьте галочку на согласии на обработку информации и нажмите «Рассчитать». Наш калькулятор подберет подходящие варианты.
В списке найдите Росгосстрах и нажмите рядом с названием компании на кнопку «Купить онлайн».
Заполните бланк заявления. Для этого укажите регион проживания, контактный телефон, данные о ТС, номер и серию паспорта, фамилию и имя с отчеством.
Оплатите новый ОСАГО.
Получите документ по электронной почте и сохраните его.

Важно! Действие электронных полисов стартует с их получения, на следующий день после того, как закончится срок старого договора. Возить с собой физическую копию не нужно.

Как внести изменения в полис

Как и процедура продления полисов, эта проблема решается с помощью интернета, без посещения офисов страховых. Чтобы изменить собственника или период использования ТС, список водителей, госномер, фамилию или номер паспорта страхователя, подайте заявление через личный кабинет на официальном сайте страховщика. Если у вас бумажный договор, вам придется посетить офис компании с необходимыми документами.Уточните заранее их полный список.

Важно! Самостоятельно менять информацию, которую содержат полисы ОСАГО, запрещено.

Как продлить полис ОСАГО — необходимые документы и действия — журнал За рулем

Полис ОСАГО входит в перечень документов, которые должен иметь при себе каждый водитель (п. 2.1.1. гл. 2 ПДД). За поездки с просроченной страховкой грозит не только штраф (п. 2 ст. 12.37. КоАП РФ), но и проблемы с компенсацией ущерба при наступлении страхового случая. Как же продлить просроченный полис автогражданки?

Порядок продления полиса ОСАГО регламентируется:

Федеральным законом «Об обязательном страховании гражданской ответственности владельцев транспортных средств» от 25.04.2002 N 40-ФЗ (последняя редакция).
«Положением о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств» (утв. Банком России 19.09.2014 N 431-П) (ред. от 16.04.2018) (зарегистрировано в Минюсте России 01.10.2014 N 34204).

По общему правилу, срок действия договора обязательного страхования составляет 1 год. (п. 1 ст. 10 ФЗ «Об обязательном страховании гражданской ответственности владельцев транспортных средств»)

Но из общего правила есть несколько исключений (п. 2–3 ст. 10 ФЗ «Об обязательном страховании гражданской ответственности владельцев транспортных средств»):

Владельцы, чьи ТС зарегистрированы в иностранных государствах и временно используются на территории Российской Федерации, заключают договоры обязательного страхования на весь срок временного использования таких ТС, но не менее чем на 5 дней.
Владелец ТС вправе заключить договор обязательного страхования на 20 дней, если у него нет диагностической карты и он:

едет регистрировать ТС. Но при этом владелец ТС до его регистрации обязан заключить договор обязательного страхования на 1 год;
едет на техосмотр (повторный, либо первичный).

Таким образом, когда срок действия полиса ОСАГО истекает, автомобилист должен немедля его продлить, обеспечивая тем самым непрерывность страхования. Договор обязательного страхования продлевается после того, как срок его действия истек, путем заключения с прежним страховщиком договора на новый срок (пп. 1. 12 гл. 1 «Положения о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств»). Продлить полис ОСАГО вы можете как у того же страховщика, так и выбрав нового (п. 1.5 гл. 1 «Положения о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств»).

По сути, процедура пролонгации договора представляет собой заключение нового договора, а значит для нее потребуется тот же пакет документов, который необходим при оформлении полиса впервые. Хотя, на практике, информацию о владельце полиса прежний страховщик может найти в базе данных, но он также вправе потребовать от страхователя персональную информацию.

Так, п. 1.1. гл. 1 «Положения о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств» сказано, что:

«Страхователь для заключения договора обязательного страхования или внесения в него изменений обязан предоставить свои персональные данные, персональные данные собственника транспортного средства, а в случае, если заключаемый договор обязательного страхования предусматривает управление транспортным средством указанными страхователем водителями, — персональные данные каждого из таких водителей, включающие в себя информацию и сведения, которые должны содержаться в заявлении о заключении договора обязательного страхования и документах, необходимых страховщику для заключения договора обязательного страхования в соответствии с Федеральным законом „Об обязательном страховании гражданской ответственности владельцев транспортных средств“.

Прежний страховщик не вправе требовать от вас представления оригиналов документов, предусмотренных ФЗ «Об обязательном страховании гражданской ответственности владельцев транспортных средств», если нет информации о том, что представленные страхователем копии документов либо электронные документы содержат неактуальные сведения (п. 1.6 гл. 1 «Положения о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств»). То есть, если вы не меняли, к примеру, фамилию, то при продлении ОСАГО нет необходимости предоставлять оригиналы ранее предоставленных документов. Важно отметить, что в законе речь идет именно об оригиналах.

Если вы пролонгируете договор у другого страховщика потребуется собрать документы, необходимые для первичной процедуры заключения договора.

Для процедуры продления договора ОСАГО потребуются следующие документы (п. 3 ст. 15 ФЗ «Об обязательном страховании гражданской ответственности владельцев транспортных средств»):

Заявление. Вместе с заявлениемо заключении договора обязательного страхования страхователь вправе предоставить страховщику сведения о страховании, полученные от страховщика, с которым был заключен предыдущий договор обязательного страхования. Но, сведения о страховании не предоставляются лицом, заключающим договор обязательного страхования со страховщиком, с которым был заключен предыдущий договор обязательного страхования (п. 1.8 гл. 1«Положения о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств»).
Паспорт или иной удостоверяющий личность документ (если страхователем является физическое лицо), свидетельство о государственной регистрации юридического лица (если страхователем является юридическое лицо).
Документ о регистрации транспортного средства, выданный органом, осуществляющим регистрацию транспортного средства (паспорт транспортного средства, свидетельство о регистрации транспортного средства, технический паспорт или технический талон либо аналогичные документы).
Водительское удостоверение или копия водительского удостоверения лица, допущенного к управлению транспортным средством (в случае, если договор обязательного страхования заключается при условии, что к управлению транспортным средством допущены только определенные лица).
Диагностическая карта, содержащая сведения о соответствии транспортного средства обязательным требованиям безопасности транспортных средств (за исключением случаев, если в соответствии с законодательством в области технического осмотра транспортных средств транспортное средство не подлежит техническому осмотру или его проведение не требуется, либо порядок и периодичность проведения технического осмотра устанавливаются Правительством Российской Федерации, либо периодичность проведения технического осмотра такого транспортного средства составляет шесть месяцев, а также случаев, предусмотренных п. 3 ст. 10 ФЗ «Об обязательном страховании гражданской ответственности владельцев транспортных средств»).

Договор обязательного страхования по выбору страхователя может быть составлен в виде электронного документа. При этом перечень сведений, передаваемых страхователем через официальный сайт страховщика в сети «Интернет» для формирования заявления о заключении договора страхования в электронной форме, включает в себя сведения, необходимые для предоставления страховщику при заполнении заявления о заключении договора обязательного страхования на бумажном носителе (п. 1.11 гл. 1 «Положения о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств»).

Документом, удостоверяющим осуществление обязательного страхования, должен являться страховой полис обязательного страхования (п. 1.4. гл. 1 «Положения о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств»).

Страховой полис обязательного страхования и копия подписанного страхователем и страховщиком (представителем страховщика) заявления о заключении договора обязательного страхования выдаются страховщиком страхователю, обратившемуся с заявлением о заключении договора обязательного страхования, и, если это предусмотрено Федеральным законом «Об обязательном страховании гражданской ответственности владельцев транспортных средств» или «Положением о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств», представившему иные документы, а также исполнившему обязанность по оплате страховой премии, незамедлительно после осуществления указанных действий (п. 1.4 гл. 1 «Положения о правилах обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств»).

Фото: Алексей Смышляев/Интерпресс/ТАСС

Как продлить полис ОСАГО в 2020 году – инструкция, советы

Что делать чтобы продлить полис ОСАГО

В зависимости от договора и условий работы страховой компании, существуют несколько способов:

автоматическое продление – подходит водителям, которые не хотят менять страховщика и условия заключенного договора. Практически у всех компаний существует возможность автоматической пролонгации, если клиент не выражает желания расторгнуть договор. Подавать заявление в данном случае не потребуется. Достаточно своевременно внести оплату за новый период страхования. На основе оплаты действие полиса будет продлено сразу по окончанию срока действия предыдущего.
продление в офисе – не самый популярный вариант. Особенно у водителей, которые хотят продлить электронный полис. Для них удобнее онлайн способ. Но при наличии вопросов, требующих консультации в личном порядке, возможна пролонгация в офисе.
продление онлайн – оптимальный вариант, позволяющий пролонгировать договор на существующих условиях или внести необходимые изменения.

Обратите внимание! Автоматическое продление требует своевременно оплаты. При просрочке действие страховки заканчивается в соответствии со сроком действия ранее оформленного документа, и далее он считается просроченным.

Как продлить полис ОСАГО онлайн

Долгое время основной причиной опозданий являлось отсутствие соответствующих бланков. По крайней мере, автовладельцам регулярно сообщали именно об этой причине.

С введением еОСАГО вопрос решился раз и навсегда.

Как продлить электронный полис:

если подключена услуга автопродления, зайдите в личный кабинет и проплатите следующий период;
если данная опция не подключена, уточните у поставщика услуг, как это сделать;
если данная опция не существует, зайдите в личный кабинет и выберите опцию «продлить ОСАГО онлайн» – в связи с обязательством оформлять еОСАГО данная опция присутствует в личном кабинете водителя у всех страхующих организаций.

В процессе продления условия страховки могут быть изменены. Например, владелец вправе добавить/удалить других водителей.

Новая версия еОСАГО будет выслана на email. Формально водитель не обязан иметь с собой физическую копию – достаточно назвать сотруднику ГИББД номер. Но на всякий случай стоит распечатать бумажную версию и возить с собой (в том числе, на случай, если не будет возможности зайти на почту и посмотреть номер).

Какие документы нужны для продления

Если вы решили продлить электронный полис онлайн, никакие дополнительные документы не потребуются, кроме диагностической карты техосмотра (если срок действия предыдущей также истек).

При личном обращении в компанию возьмите с собой:

паспорт
водительские права (всех водителей, которые будут допущены к управлению транспортным средством)
диагностическую карту
свидетельство о регистрации ТС или техпаспорт

При желании изменить условия, в офисе страховщика нужно написать соответствующее заявление, в котором указываются желаемые изменения. Если изменения не вносятся, заявление о пролонгации будет типовым, и его нужно будет только подписать.

Допустимые и рекомендуемые сроки

За сколько дней можно продлить полис ОСАГО?

Ранее по истечение срока действия страховки у водителя был 1 месяц для пролонгации. В настоящий момент правило упразднено. При истекшем сроке автовладелец не имеет права пользоваться транспортным средством, пока не начнет действовать следующий оформленный период.

Чтобы избежать накладок, рекомендуется продлевать за 2 недели до окончания срока действия предыдущего документа.

технических проблем на стороне страхующей организации
отказа в пролонгации и необходимости выбора нового поставщика услуг

Формально владелец имеет право подать заявление за 30 дней, но редкие организации предоставляют подобную возможность.

Новый срок начнется с момента окончания предыдущего – т.е. подав заявку за 2 недели вы эти 2 недели не потеряете.

Законодательно установленных сроков не существует. Просто с недействительно страховкой вы не сможете ездить. А даже оформление еОСАГО занимает время. Поэтому сами страховщики рекомендуют подавать заявку минимум за 3 – 4 дня до истечения периода действия.

На сколько можно продлить

Собираясь сменить страховщика или оказавшись в сложной финансовой ситуации, автовладельцы не хотят оплачивать целый год.

Минимальный период оформления – 3 месяца.

Но нужно учитывать, что полис, действующий менее 1 года, обойдется дороже. По статистике, в 90% случаев за 3-месячную страховку придется отдать сумму, равную 50% стоимости годового ОСАГО.

Можно ли продлить без собственника

Как и оформление, продление без владельца транспортного средства возможно – по предварительно выписанной доверенности.

Важно понимать – без доверенности пролонгацию не смогут оформить даже лица, вписанные в страховку. Оформление на несколько водителей только предоставляет право на управление транспортным средством. Любые действия непосредственно со страховкой может выполнять только владелец.

Особенности продления ОСАГО

Даже при электронной онлайн пролонгации возможны ошибки. Не стоит полагаться на непогрешимость техники.

Самые частые ошибки:

неправильно начисленный КБМ – при расчете коэффициента бонус-малус лучше держать руку на пульсе. При обнаружении несоответствия направьте просьбу о пересчете КБМ или разъяснения ситуации.
отсутствие в базе – после оформления страхования (лично или в электронной форме) соответствующие данные должны быть добавлены в течение 1 дня. На практике, компании нередко нарушают данное правило (из-за тех.сбоя или по халатности сотрудников – неизвестно). Обратитесь в компанию для устранения ошибки. Это также должно занять не более 1 дня.
неправильно заполненные данные – это ошибка, возникающая еще на стадии оформления. Но при пролонгации не поленитесь лишний раз проверить указанную информацию (ФИО, паспортные данные, информацию о транспортном средстве). Формально описка в 1-2 буквы или цифры не может являться поводом для отказа со стороны страховщика. На деле, многим владельцам приходится при наличии опечаток решать вопрос через суд.

Не ошибкой, но распространенной незаконной практикой является навязывание дополнительных услуг, если владелец решает продлить договор в офисе организации.

Помните, организация не имеет права отказать в оформлении или пролонгации без оплаты дополнительных услуг, страховых пакетов и т.д.

Сотрудник может рассказать клиенту о действующих акциях. Действительно, многие страхующие организации предлагают серьезную скидку на КАСКО при оформлении одновременно обязательной и добровольной страховки. Или снижают стоимость страхования имущества. Но только клиент может решить, насколько данные предложения ему интересны. И при отказе с его стороны пролонгация автомобильной страховки должна быть проведена без задержек, штрафов или ухудшения условий.

Обратите внимание! Согласно новому законодательству, перерасчет КБМ будет производится ежегодно 1 апреля, вне зависимости от срока заключения/продления договора с автовладельцем.

Корректировка КБМ будет происходить по страховым случаям, произошедшим с 1 апреля по 1 марта.

Для «открытых» полисов ОСАГО продление будет происходить всегда с КБМ = 1. Но сам коэффициент продолжает высчитываться и может быть использован для пролонгации на условиях «ограниченной» страховки с указанными водителями, которым разрешено управление ТС.

Почему могут отказать и что делать

Действительно, встречаются ситуации, когда страховщик по собственной инициативе отказывает клиент в продлении договора.

По закону страховщик обязан продлить полис ОСАГО. Но на практике находятся «обстоятельства непреодолимой силы», за которыми часто стоят совсем иные причины.

Что говорят представители страхового учреждения:

технические сбои в системе
полис по необъяснимым причинам не добавлен в базу
организация не может объяснить причину

Что стоит за отказом чаще всего:

частые аварии по вине страхователя;
регулярное некорректное поведение клиента;
некомпетентность сотрудников, допустивших ошибку при электронном оформлении
желание снизить число клиентов (для компаний обязательное страхование невыгодно как услуга)

Как действовать, если вам отказали?

Страхователь имеет право подать заявление о неправомочном отказе в Прокуратуру, УФАС или ЦБ РФ. Важно приложить отказ в письменной форме – обязательно получите его у сотрудника страхующей организации.

Вопрос в том, насколько выгодно это делать? Некоторые страховщики предлагают бонусы клиентам, решившим продлить ОСАГО. С другой стороны, если страховая компания от вас отказывается, стоит ли тратить время на жалобы и судебные разбирательства? Возможно, разумнее выбрать другого поставщика услуг.

В этом поможет рейтинг вверху страницы – проанализировав отзывы автовладельцев, мы выбрали организации, имеющие максимум положительных отзывов, минимум отказов и судебных разбирательств, приемлемые условия и удобную систему онлайн-оформления.

Почему не стоит навязываться

Грустная правда в том, что плата за страхование – заработок страховщика. Крупнейшие компании не делают большой разницы между «убыточными» и «прибыльными» клиентами, выравнивая разницу за счет числа страхователей и заботясь о своей репутации.

Но некоторые организации стараются отсеять «неудобных» автовладельцев.

Добиться правды можно. Но не исключено, что страховщик начнет «выживать» неугодного клиента иными способами – портачить с КБМ, завышать стоимость оформления. Отстоять права можно и в этом случае, но придется перелопатить кучу законов, а процедуру пролонгации постоянно проходить в обнимку с калькулятором и даже юристом.

Если страховщик не хочет видеть вас в числе своих клиентов, лучше обратитесь туда, где вас примут с радостью. Благо, выбор компаний сегодня большой.

Частым способом «отделаться от клиента» являются сложные капчи и СМС-коды. Если капчу как-то распознать возможно, с СМС-кодом происходят настоящие чудеса.

Вам могут отправить код одновременно в русской и латинской раскладке. Скопировать код из СМС нельзя – его нужно ввести руками. Причем чувствительными к языку окажутся даже цифры. Можно использовать форму проверки символов из другой раскладки. Но практика показывает, что проще направить жалобу в ЦБ РФ,

Подробно описанная ситуация и 10 скриншотов (чтобы точно убедить) творят чудеса – и через 2 – 3 дня у страхующей организации внезапно объявляется вменяемая капча и нормальные СМС-коды.

Не понимаете, как рассчитывается ОСАГО? Обязательно прочитайте подробную инструкцию, где мы по пунктам это описали.

Материал подготовлен на основе: Федерального Закона об ОСАГО в последней редакции, официальной информации от страховых компаний России

ОСАГО — Национальная страховая группа «РОСЭНЕРГО»

Наш калькулятор стоимости ОСАГО поможет расчитать стоимость полиса для Вас

Оформите полис ОСАГО онлайн быстро, удобно и без визита в страховую компанию

Продлите полис ОСАГО онлайн быстро, удобно и без визита в страховую компанию

Подайте заявку и наш специалист свяжется с Вами, ответит на возникшие вопросы.

Задать вопрос

Что такое ОСАГО и зачем его оформлять?

ОСАГО (Обязательное страхование гражданской ответственности) — обязательный вид страхования в целях защиты прав потерпевших на возмещение вреда, причиненного их жизни, здоровью или имуществу при использовании транспортных средств иными лицами.

Так как это Закон — то полис ОСАГО должен оформлять каждый участник дорожного движения

Какие документы необходимы для оформления полиса ОСАГО?

На автомобиль:

ПТС — паспорт транспортного средства

СТС — свидетельство о регистрации транспортного средства (при отсутствии ПТС)

Диагностическая карта для автомобилей старше 3-х лет

Владельцу:

Документ, удостоверяющий личность

Водительские удостоверения участников полиса ОСАГО

Сколько стоит полис ОСАГО?

Стоимость полиса ОСАГО определяется с учетом факторов, применяемых Страховщиком при установлении значений базовых ставок страховых тарифов и коэффициентов, устанавливаемых Банком России. Вы можете воспользоваться калькулятором ОСАГО для расчета примерной стоимости полиса.

Где оформить полис ОСАГО?

Полис ОСАГО Вы можете рассчитать стоимость полиса ОСАГО РОСЭНЕРГО, а затем и оформить у нас на сайте, а так же в любом ближайшем к Вам филиале.

Что делать в случае ДТП?

Составить заявление о происшествии.

Получить в ГИБДД протокол/постановление/определение или оформить европротокол.

Предоставить автомобиль на осмотр.

Дождаться решения о выплате.

Полезная информация и документы

ОСАГО

Европротокол – это процедура упрощенного оформления документов о дорожно-транспортном происшествии (далее – ДТП) без участия уполномоченных сотрудников полиции. Для оформления ДТП по процедуре Европротокола, участники ДТП заполняют бланк извещения о ДТП, выданный при покупке полиса ОСАГО.

Оформление ДТП в рамках Европротокола возможно при выполнении следующих условий:

гражданская ответственность участников ДТП застрахована в соответствии с Федеральным законом об ОСАГО №40-ФЗ;
ДТП произошло в результате взаимодействия (столкновения) 2 (двух) ТС (включая ТС с прицепами к ним) и в результате ДТП вред причинён только указанным ТС;
у участников ДТП отсутствуют разногласия относительно обстоятельств ДТП и повреждений ТС, что зафиксировано в Извещении о ДТП. В случае наличия разногласий, информация о них должна быть отражена в Извещении о ДТП и сведения о ДТП переданы в РСА посредством приложений «ДТП. Европротокол», «Помощник ОСАГО» либо посредством системы ГЛОНАСС (далее – средства технического контроля), установленной на ТС одного из участников ДТП.

Важно! Если перечисленные выше требования не выполняются, то оформление Европротокола невозможно, в этом случае необходимо обратиться в ГИБДД (тел. 102, 112, 911) для оформления документов о ДТП.

Заполнение одного экземпляра Извещения о ДТП участниками ДТП

Бланк извещения о ДТП состоит их 2 (двух) страниц, сведения лицевой страницы копируются на вторую страницу. Участники совместно заполняют лицевую страницу Извещения о ДТП, затем разделяют две страницы Извещения о ДТП. Каждая страница – экземпляр виновного лица и потерпевшего. Каждый участник заполняет оборотную страницу своего экземпляра Извещения о ДТП и направляет своему Страховщику по ОСАГО в течение 5 (пяти) рабочих дней с момента оформления ДТП.

Извещение о ДТП может быть составлено в электронном виде посредством приложения «Помощник ОСАГО» при наличии одновременно следующих обстоятельств (помимо указанных выше):

ДТП произошло на территории Москвы, Московской области, Санкт-Петербурга, Ленинградской области, Республики Татарстан;
владельцами ТС, участвующих в ДТП, являются физические лица;
у участников ДТП отсутствуют разногласия.

Размер выплаты по Европротоколу

Если ДТП произошло до 01.10.2019

(предусмотрено составление Извещения о ДТП только в бумажном виде):

До 100 000₽ при отсутствии разногласий у участников ДТП.
До 100 000₽ при наличии разногласий у участников ДТП и фотофиксации сведений о ДТП с помощью средств технического контроля и передачи сведений в РСА.
До 400 000₽ при отсутствии разногласий у участников ДТП и фотофиксации сведений о ДТП с помощью средств технического контроля и передачи сведений в РСА, если ДТП произошло в Москве, Московской области, Санкт-Петербурге, Ленинградской области.

Если ДТП произошло 01.10.2019 или позднее

Составление Извещения о ДТП в бумажном виде в любом регионе РФ:

До 100 000₽ при отсутствии разногласий у участников ДТП.
До 100 000₽ при наличии разногласий у участников ДТП и фотофиксации сведений о ДТП с помощью средств технического контроля и передачи сведений в РСА
До 400 000₽ при отсутствии разногласий у участников ДТП и фотофиксации сведений о ДТП с помощью средств технического контроля и передачи сведений в РСА.

Составление Извещения о ДТП в электронном виде (возможно, если ДТП произошло в Москве, Московской области, Санкт-Петербурге, Ленинградской области, Республике Татарстан):

До 100 000₽ при составлении Извещения о ДТП с помощью приложения «Помощник ОСАГО» (без фотофиксации поврежденных ТС).
До 400 000₽ при составлении Извещения о ДТП с помощью приложения «Помощник ОСАГО» (с фотофиксацей поврежденных ТС) и передачи сведений в РСА.

Опубликовано постановление о продлении срока действия диагностических карт

Срок действия диагностических карт, у которых этот срок истекает с 1 февраля по 30 сентября, продлевается на полгода, но не менее, чем до 1 октября. То есть, если карта заканчивает действовать 2 марта, то техосмотр надо будет пройти 1 октября. Если ее срок истекает 30 сентября, то получить новую надо до 30 марта следующего года.

Тем автомобилистам, возраст машин которых достиг четырех лет, придется пройти техосмотр по новым правилам. Но таких не очень много.

Продление карт происходит автоматически. То есть страховщики продадут полис без проблем с указанием номера той карты, что есть на руках.

Однако это постановление не отменяет начала реформы техосмотра, которая стартует с 1 марта. С этой даты вступают в силу поправки в закон о техосмотре, новый порядок его проведения. Диагностические карты становятся электронными, а само диагностирование будет сопровождаться фотофиксацией. Будут делаться две фотографии перед началом диагностики и после. Эти фото вместе с координатами места и временем съёмки будут также вноситься в диагностические карты.

Теперь реформа начнётся, по сути, без автовладельцев, у которых необходимость ехать на пункт ТО отпала до октября.

Решение о переносе сроков было принято из-за опасений, что реформа вызовет транспортный коллапс. Пунктов ТО и из пропускной способности на всех не хватает. А без диагностической карты невозможно приобрести полис ОСАГО. Без полиса запрещено передвигаться по дорогам. Есть опасения, что пропускной способности пунктов ТО не хватит и на автобусы. В итоге встанет общественный транспорт.

Однако возможность пройти техосмотр до октября остаётся. Благодаря тому, что постановление предусматривает увеличение срока действия диагностических карт на полгода, эффект отложенного спроса сработает мягче. Скорее всего, очереди в октябре на техосмотр будут, но не такие катастрофические, как можно было ожидать, если бы действие всех карт перенесли на 1 октября.

Напомним, что с 1 марта также меняется порядок прохождения техосмотра автобусов. Теперь он будет проводиться с участием сотрудников ГИБДД. Но благодаря этому постановлению, вряд ли владельцы автобусов повезут свои машины на ТО до 1 октября, раз их диагностические карты остаются действующими.

Как пройти повторную сертификацию | CTP

Сертификаты имеют два варианта представления отчетов о заработанных кредитах. Первым и предпочтительным вариантом является Центр ресурсов для повторной сертификации AFP.
После того, как вы заработали и сообщили все 36 кредитов, инструмент позволит
оплатить сбор за повторную сертификацию онлайн с помощью кредитной карты. Сертификаты, использующие Центр ресурсов для повторной сертификации AFP, получают скидку в размере 25 долларов на сборы, уплачиваемые теми, кто использует форму отчета о повторной сертификации.

Второй вариант — отправить форму отчета о повторной сертификации. Этот вариант необходимо использовать, когда:

Оплата чеком
Отчетность о кредитах с использованием бумажной формы

Заполненную форму необходимо отправить по почте или факсу в AFP.Мы не принимаем формы, содержащие информацию о кредитной карте, по электронной почте. Эта форма может только
будут отправлены после того, как будут заработаны все 36 баллов для повторной сертификации.

Запросить общее продление

Если вы не можете выполнить требование о 36 баллах для повторной сертификации к концу трехлетнего цикла, но работаете над выполнением этого требования, заработав по крайней мере один (1) кредит на непрерывное образование, вы можете запросить продление. Максимальный срок пролонгации — шесть месяцев, с 30 июня по 31 декабря отчетного года. Дальнейшее продление не будет.

Ваши учетные данные останутся актуальными в течение периода вашего продления, но вы сократите продолжительность следующего цикла отчетности, поскольку кредиты нельзя использовать дважды. Пожалуйста, относитесь к этой политике как к любезности.

В течение периода продления

Ваши учетные данные останутся актуальными в течение периода вашего продления, но вы сократите продолжительность вашего следующего отчетного цикла, поскольку кредиты нельзя использовать дважды.
Кредиты, заработанные в течение периода продления, не могут быть снова использованы в следующем цикле.
Тем не менее, избыточные кредиты, заработанные сверх необходимых 36, могут быть применены к следующему отчетному циклу.

Чтобы запросить добавочный номер

1. Заполните и отправьте бланк повторной сертификации по факсу или почте. Запросы на продление не могут быть отправлены через онлайн-ресурсный центр ресертификации.

Укажите ваш запрос на продление
Перечислите все зачетные единицы, заработанные на данный момент (как минимум один (1) зачет непрерывного образования должен быть указан для того, чтобы продление было предоставлено)

2.Отправьте форму вместе с платой за запрос на продление (75 долларов для членов AFP, 150 долларов для нечленов).

Для получения дополнительной информации о требованиях к повторной сертификации ОСАГО и
мероприятия / темы непрерывного образования, которые имеют право на зачет, см.
Правила повторной сертификации на сайте AFPOnline.org.

Формирование цитоофидий продлевает период полужизни ЦТФ-синтазы

Внутриклеточная компартментация биологических процессов имеет фундаментальное значение для функционирования клетки.Один из методов состоит в формировании мембраносвязанных органелл, таких как митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ER) и лизосомы, которые широко изучались в последние десятилетия. Однако недавние исследования показывают, что клетки также содержат органеллы без ограничивающей мембраны в виде жидких капель в ответ на клеточный стресс, такие как U-тельца и пуриносомы ^1,2. Разделение фаз было признано одним из механизмов динамической организации этих безмембранных органелл ³.В дополнение к этим капельным структурам, безмембранные крупномасштабные нитчатые структуры также описаны в различных метаболических ферментах ⁴.

Цитидин-5′-трифосфат (CTP) не только служит строительным блоком для РНК, но также участвует в синтезе фосфолипидов и сиалилировании белка ⁴. Самая низкая клеточная концентрация CTP среди четырех нуклеотидов (UTP, ATP, GTP и CTP) делает его молекулой, ограничивающей скорость, для синтеза нуклеиновых кислот и других CTP-зависимых событий.CTP-синтаза (CTPS) — это фермент, ограничивающий скорость, который катализирует АТФ-зависимое превращение UTP в CTP. Мы и др. Ранее наблюдали, что CTPS может быть собран в длинные безмембранные нитчатые структуры, называемые цитоофидиями в клетках плодовых мух, бактерий, дрожжей и млекопитающих ^4,5. Мы недавно сообщили о наличии цитоофидий в различных раковых тканях человека, таких как рак толстой кишки, печени и простаты. ⁶. Предыдущие исследования установили связь между цитоофидиями и ферментативной активностью CTPS ^7,8,9,10.Однако остается неясным, могут ли цитоофидии служить хранилищем CTPS и буферной системой для поддержания клеточного гомеостаза и соответствовать высоким требованиям CTP для быстрорастущих клеток, таких как раковые клетки.

Чтобы изучить влияние образования цитоофидий на уровни белка CTPS, мы сначала обработали клетки HEK-293T, стабильно экспрессирующие mCTPS1-GFP, аналогом глутамина, 6-диазо-5-оксо-1-норлейцином (DON), который может эффективно индуцируют образование цитоофидий CTPS (дополнительный рис.S1a). Наши данные показали, что уровни белка mCTPS1-GFP значительно повышались при лечении ДОН, особенно через 36 ч (рис. 1а, б). Между тем, не наблюдалось увеличения уровней информационной РНК (мРНК) mCTPS1-GFP после обработки DON (дополнительный рис. S1b). Мы недавно идентифицировали линию клеток рака толстой кишки SW480, в которой CTPS может собираться в цитоофидии без какого-либо лечения. ¹¹. Чтобы дополнительно определить влияние цитоофидий на уровни экспрессии белка CTPS, мы создали мутант mCTPS1 h455A и R294D, меченный GFP.Эти две мутации не могли образовывать цитоофидии даже при лечении ДОН (дополнительный рис. S2a). Общая структура тетрамера, которая необходима для активности CTPS, не была затронута мутацией h455A или R294D ^7,9. Моделирование структуры показало, что h455 и R294 располагаются на границе раздела между двумя последовательными тетрамерами (дополнительный рис. S2b, c). Снижение образования цитоофидий с помощью R294D и h455A может быть связано с ослаблением взаимодействия между тетрамерами CTPS1. В соответствии с предыдущим исследованием ⁹, анализ ферментативной активности in vitro не показал значительной разницы в каталитической активности между мутантом R294D и hCTPS1 дикого типа (дополнительный рис.S2d). Затем мы стабильно экспрессировали мутант mCTPS1-GFP дикого типа, h455A и R294D в клетках SW480. Как и ожидалось, mCTPS1-GFP дикого типа собирался в цитоофидии в клетках SW480 в нормальном состоянии, тогда как мутант mCTPS1-GFP h455A и R294D демонстрировал цитоплазматическое распределение и не собирался в цитоофидии (дополнительный рис. S3a). Результаты ПЦР в реальном времени не показали значительных различий в уровнях мРНК mCTPS1-GFP в клетках SW480, стабильно экспрессирующих CTPS1 дикого типа, h455A или R294D (дополнительный рис.S3б, в). Затем мы сравнили уровни белка mCTPS1-GFP в этих клеточных линиях SW480. Данные вестерн-блоттинга показали, что уровни белка mCTPS1 h455A или R294D были примерно в пять раз ниже, чем у mCTPS1 дикого типа (рис. 1c-f). Затем мы определили, действительно ли более высокий уровень mCTPS1 дикого типа, чем у h455A или мутантного mCTPS1 R294D, обусловлен образованием цитоофидий. Клетки HeLa, в которых CTPS не может образовывать нитевидную структуру в нормальных условиях, стабильно трансфицировали мутантом mCTPS1 дикого типа, h455A и R294D, а затем анализировали уровни белка и мРНК mCTPS1.Наши результаты показали, что не было очевидной разницы в уровнях белка mCTPS1 в этих трех стабильных клеточных линиях HeLa, когда уровни мРНК mCTPS1 были сходными (дополнительный рис. S4a, b).

Рис. 1: Формирование цитоофидий продлевает период полужизни CTP-синтазы.

a Клетки HEK-293T, стабильно экспрессирующие mCTPS1-GFP, обрабатывали 4 мкг / мл DON в течение указанного времени, получали клеточные лизаты и анализировали иммуноблоттингом с антителом против GFP. b Количественные данные уровня белка mCTPS1-GFP в a . c , e Клетки SW480, стабильно экспрессирующие mCTPS1 ^WT -GFP, mCTPS1H ^355A -GFP ( c ) или mCTPS1 ^R294D -GFP ( e ), культивировали в течение 3 дней, а затем подвергали к Вестерн-блоттингу с антителом против GFP. d , f Количественные данные уровня белка mCTPS1-GFP в c и e соответственно. g – i Клетки SW480, экспрессирующие эндогенный CTPS1 дикого типа (CTPS1 ^WT), и клетки, экспрессирующие мутантный CTPS1 R294D (CTPS1 ^R294D), культивировали в течение 3 дней с последующим иммуноокрашиванием ( g ) или вестерн-блоттингом против CTPS1. ( ч ). i Количественные данные об уровне белка CTPS1 в ч. . j Уровни мРНК CTPS1 клеток SW480 CTPS1 ^WT и SW480 CTPS1 ^{R294D +/-} анализировали с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR). k Принципиальная схема системы TRE3G Tet-On. l , m Клетки HEK-293T, стабильно экспрессирующие Tet-On mCTPS1-GFP, культивировали в среде, содержащей доксициклин (200 нг / мл), в течение 24 часов с последующим культивированием в среде без доксициклина без ( l ) или с ( m ) ДОН (4 мкг / мл) в течение указанного времени.Лизаты готовили и анализировали иммуноблоттингом с соответствующими антителами. n Количественные данные уровней белка mCTPS1-GFP в l и m . o Клетки HEK-293T, стабильно экспрессирующие Tet-On mCTPS1-GFP, культивировали в среде, содержащей доксициклин (200 нг / мл), в течение 24 часов с последующим культивированием в среде без доксициклина с указанной концентрацией DON в течение 48 часов. . Лизаты готовили и анализировали иммуноблоттингом с соответствующими антителами. p Клетки HEK-293T, стабильно экспрессирующие Tet-On mCTPS1 ^WT -GFP (три полосы слева) или Tet-On mCTPS1 ^h455A -GFP (три полосы справа) обрабатывали доксициклином (200 нг / мл) в течение 24 дней. ч с последующим культивированием на среде без доксициклина с указанной концентрацией ДОН в течение 48 часов. Антитело против GFP использовали для определения уровней mCTPS1-GFP. q Количественные данные уровней белка mCTPS1-GFP в p . r – t Клетки SW480, стабильно экспрессирующие Tet-On mCTPS1 ^WT -GFP ( r ), mCTPS1 ^R294D -GFP ( s ) или mCTPS1 ^h455A -GFP ( t ) выращивали в среду, содержащую доксициклин (200 нг / мл), в течение 24 ч с последующим культивированием на среде без доксициклина в течение указанного времени.Готовили лизаты и подвергали анализу вестерн-блоттингом с антителом против GFP. u Количественные данные об уровне белка mCTPS1-GFP в r — t . v Клетки HEK-293T, стабильно экспрессирующие mCTPS1-GFP, трансфицировали HA-Ubiquitin, а затем обрабатывали указанной концентрацией DON в течение 36 часов. MG132 (20 мкМ) добавляли в течение последних 16 часов обработки. Полученные лизаты подвергали иммунопреципитации антителом против GFP. Иммунопреципитаты анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против НА. w Клетки дикого типа и CTPS1 R294D мутантные SW480 клетки обрабатывали MG132 в течение 16 часов. Готовили лизаты и подвергали иммунопреципитации антителом против CTPS1. Иммунопреципитаты анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против убиквитина. Среднее ± S.E.M, * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001 по сравнению с контролем. Масштабные линейки = 20 мкм. Показан один из трех-пяти подобных экспериментов. DAPI, 40,6-диамидино-2-фенилиндол; DON, 6-диазо-5-оксо-1-норлейцин

Далее мы создали гетерозиготную линию клеток SW480 мутанта CTPS1 R294D (SW480 CTPS1 ^{R294D +/-}), чтобы определить, может ли нарушение цитоофидии снизить уровни эндогенного белка CTPS.Как показано на рис. 1g, цитоофидии CTPS с трудом обнаруживались в клетках SW480 CTPS1 ^{R294D +/-}, что позволяет предположить, что CTPS1 ^R294D может служить доминантно-отрицательной мутацией CTPS1. Данные вестерн-блоттинга показали, что уровень белка CTPS был намного ниже в клетках SW480 CTPS1 ^{R294D +/-} по сравнению с таковым в клетках SW480 CTPS1 ^WT (фиг. 1h, i). Более того, в этих двух клеточных линиях не наблюдалось различий в уровнях мРНК CTPS1 (рис. 1j). В целом, эти результаты показывают, что стимулирование сборки цитоофидий увеличивает уровни белка CTPS, в то время как нарушение цитоофидии снижает уровни белка CTPS.

Мы предположили, что цитоофидии регулируют уровни белка CTPS за счет увеличения периода полужизни белка CTPS. Чтобы проверить эту идею, была использована система экспрессии гена, индуцируемого тетрациклином Tet-On 3G, для контроля экспрессии экзогенного гена mCTPS1. В этой системе транскрипция mCTPS1 была инициирована обработкой доксициклином (Dox), в то время как транскрипция будет остановлена в отсутствие Dox (рис. 1k). Dox добавляли к клеткам HEK-293T, стабильно экспрессирующим Tet-On mCTPS1-GFP, в течение 24 ч до введения носителя (фиг.1л) или ДОН (рис. 1м) на указанное время. Наши результаты показали, что клетки, обработанные DON, показали более длительный период полужизни mCTPS1-GFP, чем клетки, обработанные носителем (рис. 1l – n). Аналогичный результат наблюдался и в системе Tet-Off. В отличие от системы Tet-On, транскрипция mCTPS1 была отключена обработкой Dox. Наши данные показали, что обработка DON может эффективно замедлять деградацию mCTPS1-GFP по сравнению с обработкой носителем (дополнительный рис. S5a, b). Исследование курса дозы также продемонстрировало, что обработка клеток HEK-293T, экспрессирующих Tet-On mCTPS1-GFP, указанной концентрацией DON в течение 48 часов после депривации Dox, значительно увеличивала уровни белка mCTPS1-GFP (рис.1o). Затем мы оценили, зависит ли накопление CTPS1 после обработки DON от сборки цитоофидий путем введения мутации mCTPS1 mCTPS1 ^h455A, которая лишена способности образовывать цитоофидии при лечении DON (дополнительные рисунки S2a и 6a). Как показано на рис. 1p, q, обработка DON резко сохранила mCTPS1-GFP дикого типа (mCTPS1 ^WT -GFP) после депривации Dox, в то время как не наблюдали разницы в уровнях белка mCTPS1 ^h455A -GFP после обработки DON в Клетки НЕК-293Т.Сходные результаты наблюдались также в клетках HeLa (дополнительный рис. S6b, c), предполагая, что обработка DON продлевает период полужизни CTPS1 за счет стимулирования сборки цитоофидий.

Для дальнейшего подтверждения роли цитоофиды в регуляции периода полужизни CTPS, клетки SW480 стабильно экспрессируют Tet-On mCTPS1 ^WT -GFP, Tet-On mCTPS1 ^h455A -GFP и Tet-On mCTPS1 ^R294D — GFP обрабатывали Dox в течение 24 часов для инициации экспрессии белка mCTPS1-GFP с последующим культивированием в среде без Dox в течение указанного времени.MCTPS1 дикого типа показал более длительный период полужизни по сравнению с таковым у h455A и мутантного mCTPS1 R294D (рис. 1r – u). Таким образом, образование цитоофидий продлевает период полужизни CTPS.

Система убиквитин-протеасома является основным путем деградации внутриклеточных белков. С помощью протеомной масс-спектрометрии идентифицировано по крайней мере 18 потенциальных сайтов убиквитинирования CTPS1. Затем мы определили влияние сборки цитоофидий на убиквитинирование CTPS. Наши данные показали резкое снижение убиквитиновой модификации mCTPS1-GFP после обработки ДОН (рис.1в). Кроме того, убиквитиновая модификация эндогенного CTPS также была увеличена в клетках SW480 CTPS1 ^{R294D +/-} по сравнению с клетками SW480 дикого типа (рис. 1w). Эти данные свидетельствуют о том, что формирование цитоофидий блокирует убиквитиновую модификацию CTPS. Таким образом, формирование цитоофидий продлевает период полужизни CTPS, вероятно, за счет маскировки определенных сайтов убиквитинирования CTPS1 и дополнительно подавляет опосредованную протеасомами деградацию CTPS1.

В целом, представленное здесь важное открытие — это демонстрация того, что формирование цитоофидий ингибирует убиквитинирование CTPS и дополнительно продлевает период полужизни CTPS.Следовательно, цитоофидии могут служить хранилищем CTPS. Корреляция между ферментативной активностью CTPS и филаментацией была изучена у разных организмов ^7,8,9,12. Что касается CTPS человека, то несколько линий доказательств in vivo из клеточных биологических исследований показали, что образование цитоофидий может блокировать активность фермента CTPS. Например, мы ранее обнаружили, что сверхэкспрессия CTPS резко способствует сборке цитоофидий CTPS в клетках 293T. Однако внутриклеточная концентрация CTP увеличилась лишь умеренно — ¹⁰.Недавнее исследование также показало, что образование цитоофидий в условиях нехватки питательных веществ снижает их ферментативную активность ⁹. Таким образом, цитоофидии могут функционировать как хранилище для защиты CTPS от деградации, так что клетка может укрывать многие белковые молекулы CTPS, не высвобождая их активность, и быстро реагировать на изменения окружающей среды. Тем не менее, повышенная ферментативная активность CTPS человека в цитоофидиях также была продемонстрирована сборкой in vitro в присутствии субстратов ⁶.В этом случае цитоофидии могут сохранять эти активные молекулы CTPS в этой крупномасштабной нитчатой структуре, чтобы удовлетворить высокую потребность в CTP в быстрорастущих клетках, таких как раковые клетки.

Экспрессия белка и каталитическая активность CTPS повышены при различных раковых заболеваниях человека ^13,14. Важно отметить, что подавление CTPS или подавление ферментативной активности CTPS может эффективно индуцировать снижение пролиферации раковых клеток и повышать чувствительность раковых клеток к химиотерапии ^14,15.Фактически, CTPS был привлекательной мишенью для борьбы с раком на протяжении десятилетий. Однако нежелательные побочные эффекты, такие как нейротоксичность, тошнота и рвота, после лечения ингибиторами CTPS препятствовали их дальнейшему развитию ^16,17. Предыдущие исследования показали, что размер и численность цитоофидий положительно связаны с активностью и экспрессией протоонкогенов, включая Myc, лимфому линии B Casitas (Cbl) и активированную cdc42-связанную киназу (Ack) у Drosophila ^{12 , 18,19}.Наше недавнее исследование продемонстрировало присутствие цитоофидий CTPS в различных раковых тканях человека ⁶. Таким образом, может быть интересно исследовать роль цитоофидий в развитии рака и устойчивости к химиотерапевтическим препаратам, а дальнейшая разработка малых молекул для нарушения сборки цитоофидий может представлять новую стратегию борьбы с цитоофида-положительными раками.

Установочные свидетельства показывают, что CTPS — не единственный компонент этих нитей. Ранее мы сообщали, что инозинмонофосфатдегидрогеназа (IMPDH), фермент, ограничивающий скорость биосинтеза de novo GTP, и аспарагинсинтетаза (ASNS), важный фермент для биосинтеза аспарагина, могут быть собраны в аналогичные волокна, прилегающие к цитоофидию CTPS ^{20 , 21}.Возможно, цитоофидии CTPS служат метаболическим стабилизатором и совместной платформой для CTPS и многих других метаболических ферментов. Различные ферменты могут координироваться друг с другом, образуя цитоофидии. В будущем представляется интересным продемонстрировать, могут ли другие метаболические ферменты также храниться в этой крупномасштабной нитевидной структуре.

Ссылки

1.
Liu, J. L. & Gall, J. G. Тельца U представляют собой цитоплазматические структуры, которые содержат богатые уридином малые ядерные рибонуклеопротеины и связаны с P-тельцами. Proc. Natl Acad. Sci. США 104 , 11655–11659 (2007).
CAS
Статья
Google Scholar
2.
Ан, С., Кумар, Р., Шитс, Э. Д. и Бенкович, С. Дж. Обратимая компартментализация биосинтетических комплексов пуринов de novo в живых клетках. Наука 320 , 103–106 (2008).
CAS
Статья
Google Scholar
3.
Boeynaems, S. et al. Разделение фаз белка: новый этап в клеточной биологии. Trends Cell Biol. 28 , 420–435 (2018).
CAS
Статья
Google Scholar
4.
Лю, Дж. Л. Цитофидиум и его виды: филаментация и компартментация метаболических ферментов. Annu. Rev. Cell Dev. Биол. 32 , 349–372 (2016).
Артикул
Google Scholar
5.
Лю, Дж. Л. Внутриклеточная компартментация CTP-синтазы у Drosophila. J. Genet. Геномика 37 , 281–296 (2010).
CAS
Статья
Google Scholar
6.
Chang, C.C. et al. CTP-синтаза образует цитоофидий в гепатоцеллюлярной карциноме человека. Exp. Cell Res. 361 , 292–299 (2017).
CAS
Статья
Google Scholar
7.
Lynch, E. M. et al. Структура филаментов CTP-синтазы человека выявляет конформацию активного фермента. Нат. Struct. Мол. Биол. 24 , 507–514 (2017).
CAS
Статья
Google Scholar
8.
Barry, R.M. et al. Крупномасштабное образование филаментов подавляет активность CTP-синтетазы. Элиф 3 , e03638 (2014).
Артикул
Google Scholar
9.
Lin, W. C. et al. Гистидин-зависимое метилирование белка необходимо для компартментализации CTP-синтазы. Cell Rep. 24 , 2733–2745 e2737 (2018).
CAS
Статья
Google Scholar
10.
Огей, Г. Н. и др. Синтез нуклеотидов регулируется образованием цитоофидия во время развития нервной системы и адаптивного метаболизма. Biol. Открыть 3 , 1045–1056 (2014).
Артикул
Google Scholar
11.
Sun, Z. & Liu, J. L. Путь mTOR-S6K1 опосредует сборку цитоофидия. J. Genet. Геномика 46 , 65-74 (2019).
12.
Strochlic, T. I. et al. Ack-киназа регулирует филаменты CTP-синтазы во время оогенеза Drosophila. EMBO Rep. 15 , 1184–1191 (2014).
CAS
Статья
Google Scholar
13.
Уильямс, Дж. К., Кизаки, Х., Вебер, Г. и Моррис, Х. П. Повышенная активность CTP-синтетазы в раковых клетках. Nature 271 , 71–73 (1978).
CAS
Статья
Google Scholar
14.
Шукла С. К. и др. Перекрестные помехи передачи сигналов MUC1 и HIF-1альфа индуцируют анаболический метаболизм глюкозы, придающий устойчивость к гемцитабину раку поджелудочной железы. Cancer Cell 32 , 392 (2017).
CAS
Статья
Google Scholar
15.
Сато, К.и другие. Глобальное метаболическое перепрограммирование колоректального рака происходит на стадии аденомы и индуцируется MYC. Proc. Natl Acad. Sci. США 114 , E7697 – E7706 (2017).
CAS
Статья
Google Scholar
16.
Earhart, R.H. et al. Фаза II испытания 6-диазо-5-оксо-L-норлейцина в сравнении с аклациномицином-А при запущенных саркомах и мезотелиомах. Инвест. Новые лекарства 8 , 113–119 (1990).
CAS
Статья
Google Scholar
17.
Rubin, J. et al. Исследование фазы II 6-диазо-5-оксо-L-норлейцина (DON, NSC-7365) при запущенной карциноме толстой кишки. Am. J. Clin. Онкол. 6 , 325–326 (1983).
CAS
Статья
Google Scholar
18.
Огхи, Г. Н., Грайс, С. Дж. И Лю, Дж. Л. Взаимодействие между Myc и CTP-синтазой у Drosophila. PLoS Genet. 12 , e1005867 (2016).
Артикул
Google Scholar
19.
Wang, P. Y. et al. Регуляция образования филаментов CTP-синтазы во время эндорепликации ДНК у Drosophila. Генетика 201 , 1511–1523 (2015).
CAS
Статья
Google Scholar
20.
Чанг, К. К., Кеппеке, Г. Д., Сунг, Л. Ю. и Лю, Дж. Л. Межфиламентное взаимодействие между IMPDH и цитоофидиями CTPS. FEBS J. 285 , 3753–3768 (2018).
CAS
Статья
Google Scholar
21.
Чжан С., Дин К., Шен К. Дж., Чжао С. и Лю Дж. Л. Филаментация аспарагинсинтетазы в Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 14 , e1007737 (2018).
Артикул
Google Scholar

Скачать ссылки

Благодарности

Эта работа была поддержана Шанхайским технологическим университетом и Национальным фондом естественных наук Китая (81500266). Мы благодарим сотрудников Интегрированной системы лазерной микроскопии Национального центра белковых исследований в Шанхае (NFPS), Zhangjiang Lab, Китай, за техническую поддержку и помощь в сборе и анализе данных.

Информация об авторе

Принадлежность

Школа естественных наук и технологий, Шанхайский технологический университет, 230 Haike Road, 201210, Шанхай, Китай
Чжэ Сун и Джи-Лун Лю
Кафедра физиологии, анатомии и Генетика, Оксфордский университет, South Parks Road, Oxford, OX1 3PT, UK
Ji-Long Liu

Вклады

ZS и Ж.-Л.Л. спроектировал и проанализировал эксперименты. Z.С. проводил опыты. З.С. и Ж.-Л.Л. написал рукопись.

Автор, ответственный за переписку

Переписка на
Цзи-Лун Лю.

Декларации этики

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Дополнительная информация

Примечание издателя: Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и принадлежностей организаций.

Дополнительная информация

Права и разрешения

Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или любом формате при условии, что вы надлежащим образом укажете автора (авторов) и источник, укажите ссылку на лицензию Creative Commons и укажите, были ли внесены изменения. Изображения или другие материалы третьих лиц в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной линии для материала.Если материал не включен в лицензию Creative Commons для статьи и ваше предполагаемое использование не разрешено законодательными актами или превышает разрешенное использование, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Перепечатки и разрешения

Об этой статье

Цитируйте эту статью

Sun, Z., Liu, JL. Формирование цитоофидий продлевает период полужизни CTP-синтазы. Cell Discov 5, 32 (2019). https://doi.org/10.1038/s41421-019-0098-6

Скачать цитату

Дополнительная литература

Гипоосмоляльность нарушает целостность цитоофидия во время азотного голодания.
- Yi ‐ Lan Li
- и Ji ‐ Long Liu
Дрожжи
(2021 год)
Поляризованное поддержание цитоофидии в эпителии фолликулов дрозофилы
- Цяо-Ци Ван
- , Пейяо А.Чжао
- , Омюр Ю. Тастан
- и Цзи-Лун Лю
Experimental Cell Research
(2021 год)
Регулятор транскрипции гистонов Slm9 необходим для биогенеза цитоофидий.
- Хан-Чао Фэн
- , Христос Андредис
- и Цзи-Лун Лю
Experimental Cell Research
(2021 год)
Высокоэффективное проксимальное мечение у дрозофилы
- Бо Чжан
- , Юаньбин Чжан
- , Цзи-Лун Лю
- и Б. Дж. Эндрюс
Гены G3 | Геномы | Генетика
(2021 год)
Нарушение ASNS укорачивает цитоофидии CTPS у Saccharomyces cerevisiae
- Shanshan Zhang
- , Han-Chao Feng
- , Ji-Long Liu
- и C Hoffman
Гены G3 | Геномы | Генетика
(2021 год)

Формирование цитоофидий продлевает период полужизни ЦТФ-синтазы

Рис.1. Формирование цитоофидий продлевает период полужизни CTP-синтазы.

a Клетки HEK-293T, стабильно экспрессирующие…

Рис. 1. Формирование цитоофидий продлевает период полужизни CTP-синтазы.

Диссертация | Гарвардская школа повышения квалификации

Диссертация — это возможность работать независимо над исследовательским проектом по вашему собственному проекту и вносить вклад в научную литературу в вашей области.Вы выходите из процесса диссертации с твердым пониманием того, как выполняется оригинальное исследование и как лучше всего сообщать результаты исследования. Многие студенты опубликовали свои исследования в академических или профессиональных журналах.

Ниже приведены несколько шагов, которые необходимо выполнить для выполнения требований диссертации. Пожалуйста, знайте, что на каждом этапе вы будете получать рекомендации и наставничество.

1. Определите тему диссертации и предварительный вопрос

После завершения 24 кредитов, но до завершения 32, вы работаете с назначенным вам научным руководителем, чтобы сузить свои академические интересы до актуальной и управляемой темы диссертации.Войдите в MyDCE, а затем в сообщество ALB / ALM, чтобы назначить встречу с назначенным вам научным консультантом через портал соискателей степени.

Темы предложения

Мы составили это одностраничное руководство, чтобы помочь вам сформировать представление о выборе темы. Ниже приведены некоторые предостережения относительно выбора темы.

Прилагаются все усилия для поддержки ваших исследовательских интересов, которые основаны на вашей курсовой работе ALM, но руководство факультета доступно не для всех возможных проектов.Поэтому может потребоваться доработка или изменение темы диссертации.
Это особенно актуально для научных исследований, которые зависят от лабораторных площадей, финансирования проекта и доступа к частным базам данных.
Это также важно для наших кандидатов в ALM, гуманитарных наук (английский язык, правительство, история, международные отношения, психология и т. Д.), Которым требуется, чтобы преподаватели Гарварда руководили их дипломными проектами. Просмотрите онлайн-каталог курсов Гарвардского колледжа, а также все выпускные школы (my.harvard.edu), чтобы убедиться, что существуют преподавательские курсы, связанные с темой вашей диссертации. Если нет, вам нужно будет выбрать альтернативу.
Дипломная работа представляет собой вдумчивое участие в новой академической стипендии. Вы не можете перенаправить предыдущее исследование. Если вы хотите использовать или расширить свою предыдущую стипендию для небольшой части своей диссертации, вам необходимо получить явное разрешение вашего научного руководителя и процитировать работу как в заявке, так и в диссертации. Нарушения этой политики будут переданы в Административный совет.

2. Подготовка CTP Prework

Следующим шагом в этом процессе является прохождение учебного курса или курса «Создание дипломного предложения» (CTP). CTP обеспечивает существенное продвижение к диссертации, отображая критические вопросы дизайна исследования (объем, актуальность для области, предшествующие научные дебаты, методология и, возможно, показатели для оценки воздействия, а также сравнительный анализ). CTP выявляет и преодолевает потенциальные препятствия на пути к успешному завершению дипломной работы, позволяя диссертационному проекту начать работу в полную силу.

Чтобы иметь право на регистрацию CTP, вы должны иметь хорошую репутацию и получить как минимум 32 применимых степени, а также требования к статистике / методам исследования, если они имеют отношение к вашей области. Вам также необходимо отправить предварительную работу CTP. Вот руководящие принципы подготовки к работе над диссертацией.

Консультации для кандидатов в биологии, биотехнологии, биоинженерии и нанотехнологий : Дипломные проекты в этих областях предназначены для поддержки текущих научных исследований, проводимых в Гарвардском университете , других академических учреждениях и лабораториях медико-биологической отрасли и обычно под руководством главный исследователь (ИП).Следовательно, вам необходимо иметь руководителя диссертации, утвержденного вашим научным руководителем до для подачи предварительной работы CTP. Затем предварительная работа вашей CTP оформлена в соответствии с исследованиями лаборатории. Назначьте встречу со своим научным руководителем за несколько месяцев до крайних сроков предварительной работы CTP, чтобы обсудить потенциальные исследовательские проекты и назначение руководителя диссертации.

CTP Prework отправляется на наш центральный электронный ящик: [email protected] между следующими твердыми сроками:

1 апреля и 1 июня для осенней ОСАГО
1 сентября и 1 ноября для весенней ОСАГО.
1 августа и 1 октября для трехнедельной январской сессии (только устойчивость)
1 февраля и 15 марта для трехнедельной летней сессии (только устойчивость).

Ваш научный руководитель предоставит отзыв о вашей предварительной работе, предлагая возможные дополнения или изменения для получения одобрения регистрации CTP. Ваш научный руководитель одобрит или не утвердит вашу отредактированную заявку. Если не утверждено, вам потребуется дополнительное время для дальнейших изменений, а затем отправить исправленные предварительные работы в течение следующего периода времени подачи предварительных работ CTP на следующий срок (если позволяет ваш пятилетний крайний срок).

3. Зарегистрируйте и заполните ОСАГО

После утверждения предварительной работы CTP вы регистрируетесь на курс или учебное пособие «Создание тезисов» (CTP), как и на любой другой курс. Целью CTP является создание полного, хорошо написанного проекта предложения, содержащего все разделы, необходимые вашему научному консультанту. Создание академически сильной диссертации создает основу для высококачественной диссертации и привлекает внимание уважаемого руководителя диссертации. Объем предложения обычно составляет от 15 до 25 страниц.

Учебник CTP не является курсом в традиционном понимании. Вы работаете над своим предложением независимо со своим научным консультантом, отправляя несколько проектов предложений и планируя индивидуальные встречи (обычно в течение 9-5 часов). Вам необходимо самостоятельно продвигать предложение без особой подсказки со стороны научного консультанта. Вы получаете итоговую оценку SAT или UNSAT (неудовлетворительная оценка). CTP для устойчивости — это трехнедельный курс в традиционном понимании, и вы получаете буквенную оценку, и она должна быть B- или выше, чтобы получить зачетную степень по курсу.

Ожидается, что вы учтете все отзывы своего научного руководителя и будете полностью привержены выработке академически сильного предложения, ведущего к диссертации, достойной степени Гарварда. Если вы не можете посоветоваться со своим научным руководителем, следовать указаниям или подготовить приемлемое предложение, вы не пройдете CTP, и у вас будет (если позволяет пятилетний срок получения степени) еще одна попытка заполните ОСАГО до того, как вам потребуется выйти из программы.

Человек

Если ваша диссертация, независимо от области (английская литература или психология), будет включать использование человеческих субъектов (например, интервью, опросы, наблюдения), вам необходимо, чтобы ваше исследование было проверено Комитетом по использованию человеческих субъектов ( CUHS) Гарвардского университета. Пожалуйста, загрузите и просмотрите руководство по подаче заявки, пока вы находитесь на этапе написания предложения. Ваш научный руководитель поможет вам подготовить черновой вариант формы протокола проекта, который вам нужно будет отправить в CUHS.Проверка должна происходить во время обучения CTP, чтобы ее можно было провести до назначения руководителя диссертации.

4. Постановление и оформление дипломной работы руководителя диссертации

После того, как вы (1) успешно завершите CTP и (2) ваше предложение официально одобрено вашим научным руководителем (RA), вы перейдете к этапу назначения руководителя диссертации. Обратите внимание, что успешное завершение CTP — это не то же самое, что наличие официально одобренного предложения. Это два разных шага.

Если вы изучаете естественные науки (например, биологию), ваш руководитель диссертации был определен до CTP, и теперь вам нужен руководитель диссертации, чтобы утвердить предложение.

Научный руководитель отвечает за размещение вас с руководителем диссертации. Если явно не указано иное (например, для кандидатов в программе устойчивого развития), не обращайтесь к преподавателям с просьбой о написании вашей диссертации без утвержденного предложения по диссертации и разрешения вашего научного руководителя.

Когда будет определен руководитель диссертации или предложение по диссертации будет полностью проверено заранее назначенным руководителем диссертации по медико-биологическим наукам, вы получите письмо-разрешение от заместителя декана академических программ, официально одобряющее вашу диссертационную работу и предоставляющее вам инструкции. о том, как зарегистрироваться для получения восьмикредитной магистерской диссертации. В письме также будет указана предварительная дата окончания, а также три даты обязательной подачи тезисов.

Стоимость обучения

Чтобы обеспечить доступность, стоимость дипломной работы такая же, как и в случае с нашим обычным курсом обучения: (4 кредита х два) для магистерской диссертации с 8 кредитами.

Расписание диссертаций

Дата назначения директора дипломной работы определяет цикл выпуска, который будет автоматически назначен вам.

Вы подаете диссертацию не сразу в конце, а в три этапа. Не могут быть пропущены сроки для (1) полного проекта, (2) окончательного проекта и (3) утвержденного проекта формата для вашего назначенного цикла выпуска. Вы должны предоставить материалы до даты, указанной до 17:00 (включая даты, приходящиеся на выходные). Если вы опоздаете, вы не сможете получить высшее образование в течение назначенного вам цикла. Если вам нужно дополнительное время для завершения вашей диссертации после даты, когда она должна быть передана директору диссертации (первая фаза), вам нужно будет официально запросить продление (одобренное вашим директором), отправив это ходатайство по электронной почте: [email protected]. edu. Ни в коем случае студентам не будет предоставлено более 12 месяцев для написания диссертации, включая любые предоставленные продления времени.

908 15 ноября

Чтобы получить высшее образование в…	май	ноябрь	март
Назначение дипломного директора (TD)	16 марта — 30 июня 1 827	16 ноября — 15 марта
Трехмесячная регистрация с предварительной проверкой формата	1 июня — 30 сентября	1 октября — 28 февраля	1 февраля — 30 июня
Полный черновик для комментариев к TD У вас есть один месяц на внесение всех изменений, запрошенных TD .	1 февраля	15 июля	15 ноября
Окончательный черновик (с изменениями TD) передан советнику по исследованию для проверки формата . У вас есть один месяц на внесение всех изменений в формат.	1 марта	15 августа	15 декабря
Черновик, утвержденный форматом, представлен в TD для оценки TD имеет две недели на оценку.	1 апреля	15 сентября	15 января
Руководитель дипломной работы должен представить оценку	15 апреля	1 октября	1 февраля

Обратите внимание: ALM Проведите трехмесячную встречу с вами и вашим руководителем диссертации.Если в это время ваш руководитель диссертации сообщает, что вы не добились каких-либо успехов в своей диссертации, декан академических программ оставляет за собой право выставить оценку незавершенной диссертации (TNC) (см. Оценка диссертации ниже).

5. Проведение диссертационных исследований

После регистрации в тезисе вы работаете усердно и независимо, следуя советам руководителя вашей диссертации, последовательно и регулярно, что эквивалентно полной академической работе, чтобы завершить исследование в требуемые сроки.

Вы должны подготовить не менее 50 страниц текста (не включая титульный лист и приложения). Темы глав (например, введение, предыстория, методы, выводы, заключение) различаются в зависимости от области.

6. Просмотр формата

Все дипломные проекты ALM должны соответствовать определенному формату Гарвардского университета. Правильно оформленная диссертация — это явное требование к ученой степени; вы не сможете получить высшее образование без этого.

Ваш научный руководитель заполнит формат проверки до , чтобы отправить вашу диссертацию вашему директору для окончательной оценки в соответствии с Графиком диссертаций (см. Выше).

Вы должны использовать наш шаблон диссертации ALM. В него встроено обязательное форматирование тезисов. Помимо предоставления вам шаблона, который сэкономит вам значительное количество времени при написании тезиса, вам необходимо использовать предварительно запрограммированную форму, чтобы убедиться, что представленный тезис соответствует обязательным рекомендациям по стилю ALM для поля, шрифт, титульный лист, оглавление и заголовок главы.

Если вы используете шаблон тезисов ALM, проверка формата должна пройти гладко, в противном случае весьма вероятно отложенное окончание.

7. Распространение и архивирование обязательных тезисов

После того, как вы окончили экзамен — вы получили требуемую оценку и все отредактировали, — вы загружаете свою диссертацию в электронную систему подачи тезисов и диссертаций Гарвардского университета (ETD). Дипломный проект будет отправлен в несколько последующих систем:

Ваша работа будет сохранена и передана в цифровом репозитории Гарварда DASH (Цифровой доступ к стипендиям в Гарварде).
Метаданные о вашей работе будут отправлены в HOLLIS (каталог библиотеки Гарварда).
Ваша работа будет сохранена в DRS2 Гарвардской библиотеки (цифровое хранилище).

Отправляя работу через ETDs @ Harvard, вы подписываете Гарвардское авторское соглашение, которое предоставляет Университету неисключительную лицензию на сохранение, воспроизведение и демонстрацию работы. Эта лицензия не ограничивает ваши права на последующую публикацию вашей работы. Вы сохраняете за собой все права на интеллектуальную собственность. Пожалуйста, ознакомьтесь с Гарвардским авторским соглашением для получения полной информации.

Для получения дополнительной информации об инициативах Гарварда в области открытого доступа мы рекомендуем вам ознакомиться с кратким введением директора Управления научных коммуникаций (OSC) Питера Субера.

Оценка диссертации

По дипломной работе вам необходимо получить оценку B- или выше. Все стандартные письменные оценки курса доступны руководителю вашей диссертации. Если вам не удастся выполнить основательную работу над диссертацией, вы получите оценку TNC (диссертация не завершена). Если вы уже получили две оценки по выбору, оценка TNC будет считаться нулевой в вашем совокупном среднем балле.

Если вы получили оценку ниже B-, вам нужно будет подать прошение в Административный совет о разрешении повторить попытку работы над диссертацией во второй и последний раз. Процесс подачи петиции доступен только в том случае, если у вас хорошая академическая успеваемость и пятилетний крайний срок для получения степени позволяет получить больше времени. Срок действия вашей кандидатуры автоматически истекает, если вы не завершите диссертацию в установленный срок.

В случае утверждения второй попытки вам может потребоваться разработать новое предложение по другой теме путем повторной регистрации в CTP и назначения другого руководителя диссертации.Стоимость обучения за вторую попытку рассчитывается по курсу текущего года.

Если, не сдав диссертацию, ваша академическая успеваемость ухудшится, вам нужно будет пройти дополнительные курсы, на которые можно получить степень, чтобы вернуться к хорошей репутации, прежде чем снова заниматься диссертацией во второй и последний раз. Это вариант, только если ваш пятилетний крайний срок для получения степени позволяет больше времени.

Комиссия рассматривает только те случаи, когда смягчающие обстоятельства помешали успешной сдаче диссертации.

Консультационное примечание о предварительной работе CTP: в редких случаях, когда студент представляет работу, эквивалентную утвержденному предложению, на этапе предварительной работы CTP или даже в начале учебного курса CTP, студент должен будет заменить CTP на 4- кредит по выбору, который необходимо заполнить с оценкой B- или выше, чтобы получить высшее образование с обязательными 48 кредитами. Эти случаи будут доведены до сведения заместителя декана по академическим программам, который имеет право требовать от кандидатов следовать этому альтернативному пути.

Ежегодный симпозиум по диссертациям

Вас могут пригласить представить свое исследование на ежегодном симпозиуме по диссертациям, который состоится в конце мая. Подробная информация о приглашениях на презентации будет отправлена вам в течение года обучения.

Полимеризация

CTP-синтазы в зародышевых клетках развивающегося яйца Drosophila поддерживает яйценоскость | Биология Открыть

CTP-синтаза (CTPS) является важным ферментом, опосредующим синтез de novo пиримидина, катализируя АТФ-зависимое аминирование UTP в CTP.Как и ожидалось для ограничивающего скорость фермента в критическом пути биосинтеза, CTPS подвержен многочисленным типам посттранскрипционной регуляции, включая аллостерическую регуляцию нуклеотидами (например, GTP) (Habrian et al., 2016; Lunn et al., 2008), посттрансляционная модификация (фосфорилирование) (Chang et al., 2007; Kassel et al., 2010) и сборка в гомомерные полимеры микронного размера (Barry et al., 2014; Ingerson-Mahar et al., 2010; Liu, 2010) ; Noree et al., 2010). Роль полимеризации была особенно загадочной (Liu, 2011), хотя сообщается, что она повышает стабильность белка CTPS (Sun and Liu, 2019).Бактериальные и эукариотические CTPS существуют в основном в тетрамерной форме, которая в дальнейшем может собираться в линейные протофиламенты (Barry et al., 2014; Lynch et al., 2017). Интересно, что бактериальные и эукариотические CTPS собираются в структурно разные протофиламенты, при этом сборки бактериальных CTPS проявляют пониженную каталитическую активность (Barry et al., 2014), в то время как сборки CTPS1 человека проявляют большую активность, чем их базальные тетрамеры (Lynch et al., 2017). Кроме того, в клетках обоих царств полимеры тетрамеров CTPS (протофиламенты) могут ассоциироваться латерально в гораздо более крупные нитевидные макромолекулярные пучки, которые могут быть десятки микрон в длину и сотни нанометров в ширину (Liu, 2011).Кроме того, были идентифицированы другие белки, не участвующие непосредственно в биосинтезе пиримидина, которые могут совместно собираться с CTPS в этих более крупных структурах in vivo (Chang et al., 2018; Keppeke et al., 2015; Strochlic et al., 2014) .

Является ли сборка в этих ультраструктурах важной для функции CTPS, неизвестно, отчасти из-за отсутствия инструментов, чтобы полностью нарушить сборку нитей CTP в их естественном контексте, но без устранения каталитической активности CTPS.Возможным инструментом, который может решить эту проблему, является точечный мутант CTPS, который предотвращает сборку CTPS, и ранее сообщалось о нескольких таких мутантах, включая A20R (Huang et al., 2017), R294D (Lin et al., 2018) и Histidine 355A (Lynch и др., 2017). Однако основная проблема при интерпретации экспериментов с этими мутантами заключается в том, что, за исключением R294D (Lin et al., 2018), неизвестно, влияет ли экспрессия этих несборных мутантов также на сборку эндогенных мутантов дикого типа. CTPS.В результате клетки могли экспрессировать смесь диффузных мутантных CTPS и полимеризованных CTPS дикого типа.

Чтобы разработать инструмент для доминирующего ингибирования сборки эндогенного CTPS в живых организмах, мы сосредоточились на характеристике эффектов мутации h455A. h455A расположен в спиральной вставке домена GAT CTPS, которая опосредует полимеризацию CTPS (Lynch et al., 2017). Рекомбинантный человеческий CTPS1 ^h455A собирается в структурно нормальные тетрамеры, но эти тетрамеры не могут в дальнейшем собираться в линейные протофиламенты (Lynch et al., 2017). Кроме того, CTPS ^h455A не может собираться в более крупные структуры микронного размера при экспрессии в культивируемых клетках (Sun and Liu, 2019). In vitro , Drosophila CTPS ^h455A проявляет пониженную каталитическую активность (Zhou et al., 2019), как и человеческий CTPS1 ^h455A (Lynch et al., 2017), тогда как CTPS2 ^h455A проявляет активность, аналогичную активности диких животных. CTPS2 -типа (Линч и Коллман, 2020). Эти наблюдения согласуются с моделью, согласно которой h455A блокирует сборку в обеих изоформах, но эта сборка только усиливает каталитическую активность изоформы CTPS1 (Lynch et al., 2017). CTPS собирается в различных эукариотических организмах и клеточных линиях в условиях либо пониженных уровней CTP, либо повышенной потребности в нуклеотидах (Chen et al., 2011; Noree et al., 2010; Strochlic et al., 2014). Вместе эти наблюдения предполагают, что полимеризация CTPS1 у эукариот может служить гомеостатическим механизмом для увеличения потока биосинтеза нуклеотидов в периоды, когда спрос превышает предложение.

Яичник Drosophila — одна из наиболее охарактеризованных тканей многоклеточных животных, в которой сборка CTPS происходит как часть нормальной физиологии (Aughey et al., 2016; Gou et al., 2014; Wang et al., 2015). В нормальных условиях роста как клетки зародышевой линии, дающие начало развивающейся яйцеклетке, так и соматические фолликулярные клетки, которые окружают половые клетки в развивающихся камерах яйца, обнаруживают филаменты CTPS (Liu, 2010; Strochlic et al., 2014). В клетках зародышевой линии филаменты CTPS временно собираются на ранних стадиях (стадии 1–10) развития яйцеклетки и резко разбираются на стадии 10, непосредственно перед «сбросом», когда цитозольное содержимое 15 «кормящих» клеток в кисте зародышевой линии переносятся в развивающийся ооцит (Liu, 2010; Strochlic et al., 2014). Период развития, в течение которого CTPS собирается в филаменты, совпадает с периодом, в течение которого ядра клеток-медсестер проходят несколько раундов эндорепликации (Dej and Spradling, 1999), а рибосомная РНК резко активируется (Mermod et al., 1977), что представляет собой огромное увеличение. в потребности в нуклеотидах. Гипоморфные самки мутантов единственного гена, кодирующего CTPS, у мух бесплодны, а их яичники обнаруживают серьезные дефекты морфологии, соответствующие пониженным уровням CTP (Strochlic et al., 2014). Более того, эти фенотипы восстанавливаются за счет повторной экспрессии мутанта CTPS, формирующего филаменты, в зародышевых клетках яичников (Strochlic et al., 2014), демонстрируя клеточно-автономную потребность в CTPS в оогенезе, которая может быть удовлетворена с помощью полимеризованного CTPS. Эти данные демонстрируют биологическую функцию нитчатых CTPS, но не проверяют, важна ли сборка как таковая для этой функции. Недавняя идентификация точечного мутанта CTPS h455A (Lynch et al., 2017) и доступность мощных генетических инструментов для тканеспецифической экспрессии генов у Drosophila побудили нас использовать эту систему, чтобы напрямую проверить, дает ли сборка CTPS какие-либо функциональные преимущества. в этом естественном биологическом контексте.

Нарушение ASNS укорачивает цитоофидии CTPS у Saccharomyces cerevisiae | Гены G3 | Геномы | Генетика

20″> Введение

В 2010 году три лаборатории независимо друг от друга сообщили, что CTP-синтаза (CTPS) собирается в нитчатые структуры, называемые цитоофидиями, у бактерий, дрожжей и плодовых мух (Ingerson-Mahar et al. 2010; Liu 2010; Noree et al. 2010) . Эти недавно открытые безмембранные структуры, образованные метаболическими ферментами, оказались эволюционно консервативными (Chen et al., 2011; Azzam and Liu 2013; Barry et al. 2014; Aughey et al. 2016; Лю 2016; Daumann et al. 2018; Andreadis et al. 2019; Сунь и Лю 2019a, 2019b; Ву и Лю 2019; Чжан и Лю 2019; Zhou et al. 2019; Zhang et al. 2020a, 2020b; Zhou et al. 2020). На сегодняшний день понимание цитоофидий значительно расширилось за счет полногеномного скрининга Saccharomyces cerevisiae , и было замечено, что большинство метаболических ферментов образуют нитчатые или пунктированные цитоофидии (Shen et al. 2016; Noree et al. 2019a). Эти ферменты охватывают множество биологических реакций, таких как метаболизм глюкозы, механизмы инициации трансляции и биосинтез пуринов (Shen et al. 2016; Noree et al. 2019a).

Аспарагинсинтетаза (ASNS) катализирует АТФ-зависимый биосинтез аспарагина из аспарагиновой кислоты de novo, и было обнаружено, что он образует цитоофидии в почкующихся дрожжах. В Escherichia coli существует два типа ASNS, зависимые от глутамина и зависимые от аммиака (Humbert and Simoni 1980; Ramos and Wiame 1980). ASN1 и ASN2 оба кодируют глутамин-зависимый ASNS у почкующихся дрожжей. Только двойной мутант ASN1 и ASN2 приведет к полной ауксотрофии (Jones 1978; Ramos and Wiame 1980; Dang et al. 1996). Asn1 и Asn2 имеют большое сходство с точки зрения размера белка и аминокислотной последовательности. Возможности Asn1 и Asn2 в образовании цитоофидий различны, и образование цитоофидия Asn2 зависит от присутствия Asn1 (Zhang et al. 2018; Noree et al. 2019b).

CTP является предшественником биосинтеза ДНК и РНК и участвует в метаболизме нуклеотидов и биосинтезе мембранных фосфолипидов. Ограничивающая скорость стадия биосинтеза de novo CTP катализируется CTPS. URA7 и, в меньшей степени, URA8 — это гены, которые кодируют CTPS в S. cerevisiae (Ozier-Kalogeropoulos et al. 1994), а Ura7 и Ura8 очень похожи по размеру белка и аминокислотам. кислотная последовательность.Максимальная экспрессия CTPS наблюдается в экспоненциальной фазе (Nadkarni et al. 1995). Было доказано, что образование цитоофидия CTPS в бактериях подавляет ферментативную активность (Barry et al. 2014), тогда как в клетках человека образование цитоофидия CTPS1 увеличивает ферментативную активность (Lynch et al. 2017). Drosophila CTPS может образовывать конформационно разные филаменты, связанные с субстратом и продуктом (Zhou et al. 2019).Конформация цитоофидия CTPS2 может переключаться между активной и неактивной формами в зависимости от уровня субстрата и продукта (Lynch and Kollman 2020). Эти результаты исследований подтверждают, что образование цитоофидия обеспечивает дополнительный уровень регуляции метаболизма.

Пространственные отношения между цитоофидиями ASNS и CTPS наблюдались как паттерн «голова к голове» или «бок о бок» (Zhang et al. 2018). Чтобы лучше понять связь между этими двумя типами цитоофидий, мы исследуем влияние делеции ASNS на цитоофидии CTPS и наоборот.Мы также изучаем изменения цитоофидий ASNS и CTPS в ответ на различные культуральные среды.

26″> Штаммы дрожжей и питательные среды

штаммов дрожжей, использованных в этом исследовании, были получены путем трансформации BY4741 (предоставлен Jinqiu Zhou из Шанхайского института биохимии и клеточной биологии). Трансформацию проводили методом ацетата лития. Генерация клеток URA7-GFP ASN1-MCHERRY и ASN1-GFP ASN2-MCHERRY была описана в нашем предыдущем исследовании (Zhang et al. 2018). Генотипы всех штаммов перечислены в таблице 1. Клетки Saccharomyces cerevisiae культивировали в стандартной обогащенной среде (YPD: 2% пептон, 1% дрожжевой экстракт, 2% декстроза) или YPG (2% пептон, 1% дрожжевой экстракт, 2% галактозы) при 30 ° C, если не указано иное.

Таблица 1 Штаммы

Saccharomyces cerevisiae , использованные в этом исследовании

Asn1-mCherry

Asn1-mCherry

Asn1-mCherry (HisraM)

Asn1 :: URA3 △

Ura7 GFP (His3MX6)

Имя Strain

908
.

Asn1-mCherry

Asn1-mCherry (HisraM)

Asn1 :: URA3 △

Ura7 GFP (His3MX6)

Название штамма .	Генотип .
BY4741	MATα his3Δ leu2Δ ura3Δ0 met15Δ
Ura7-GFP Asn1-mCherry	mCherry
Asn1-GFP Asn2-mCherry	As BY4741, asn1-GFP (His3MX6), asn2-mCherry (KanMX6)
907 Asherry 907 Asherry 907 Asherry 907 Asherry BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn1-mCherry (KanMX6) P _GAL10 -ASN1
Gal-Asn1-GFP Asn2-mCherry	907 as BY1 -mCherry (KanMX6) P _GAL10 -ASN1
Ura7-GFP Asn1 △	As BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn1 :: URA3	As BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn2 :: URA3 90 765
Asn1-GFP Ura7 △	As BY4741, Asn1-GFP (His3MX6), ura7 :: URA3
Ura7 ^WT47
Ura7 ^h460A -GFP	As BY4741, ura7 ^h460A -GFP (His3MX6)
Генотип .
BY4741	MATα his3Δ leu2Δ ura3Δ0 met15Δ
Ura7-GFP Asn1-mCherry	mCherry
Asn1-GFP Asn2-mCherry	As BY4741, asn1-GFP (His3MX6), asn2-mCherry (KanMX6)
907 Asherry 907 Asherry 907 Asherry 907 Asherry BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn1-mCherry (KanMX6) P _GAL10 -ASN1
Gal-Asn1-GFP Asn2-mCherry	907 as BY1 -mCherry (KanMX6) P _GAL10 -ASN1
Ura7-GFP Asn1 △	As BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn1 :: URA3	As BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn2 :: URA3 90 765
Asn1-GFP Ura7 △	As BY4741, Asn1-GFP (His3MX6), ura7 :: URA3
Ura7 ^WT47
Ura7 ^h460A -GFP	As BY4741, ura7 ^h460A -GFP (His3MX6)

Таблица 1 cerevisia, использованная в исследовании штаммов Sacvisia64

Asn1-mCherry

Asn1-mCherry (HisraM)

Asn1 :: URA3 △

Ura7 GFP (His3MX6)

Имя Strain

908
.

Asn1-mCherry

Asn1-mCherry (HisraM)

Asn1 :: URA3 △

ura7 GFP (His3MX6)

Название штамма .	Генотип .
BY4741	MATα his3Δ leu2Δ ura3Δ0 met15Δ
Ura7-GFP Asn1-mCherry	mCherry
Asn1-GFP Asn2-mCherry	As BY4741, asn1-GFP (His3MX6), asn2-mCherry (KanMX6)
907 Asherry 907 Asherry 907 Asherry 907 Asherry BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn1-mCherry (KanMX6) P _GAL10 -ASN1
Gal-Asn1-GFP Asn2-mCherry	907 as BY1 -mCherry (KanMX6) P _GAL10 -ASN1
Ura7-GFP Asn1 △	As BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn1 :: URA3	As BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn2 :: URA3 90 765
Asn1-GFP Ura7 △	As BY4741, Asn1-GFP (His3MX6), ura7 :: URA3
Ura7 ^WT47
Ura7 ^h460A -GFP	As BY4741, ura7 ^h460A -GFP (His3MX6)
Генотип .
BY4741	MATα his3Δ leu2Δ ura3Δ0 met15Δ
Ura7-GFP Asn1-mCherry	mCherry
Asn1-GFP Asn2-mCherry	As BY4741, asn1-GFP (His3MX6), asn2-mCherry (KanMX6)
907 Asherry 907 Asherry 907 Asherry 907 Asherry BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn1-mCherry (KanMX6) P _GAL10 -ASN1
Gal-Asn1-GFP Asn2-mCherry	907 as BY1 -mCherry (KanMX6) P _GAL10 -ASN1
Ura7-GFP Asn1 △	As BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn1 :: URA3	As BY4741, ura7-GFP (His3MX6), asn2 :: URA3 90 765
Asn1-GFP Ura7 △	As BY4741, Asn1-GFP (His3MX6), ura7 :: URA3
Ura7 ^WT47
Ura7 ^h460A -GFP	As BY4741, ura7 ^h460A -GFP (His3MX6)

36″> Лечение аналогом глутамина

Аналог глутамина 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин (ДОН) использовали для обработки клеток ASN1-GFP ASN2-mCherry .Мы культивировали клетки в стандартной богатой среде (YPD) с содержанием DON 0%, 2% и 4% соответственно. После 7 дней культивирования, когда клетки находились в стационарной фазе, их собирали и фиксировали 4% PFA.

Для подсчета численности цитоофидий вручную подсчитывали более 1000 клеток для каждого штамма в каждом испытании. Три группы испытаний в основном проводились вручную. Для подсчета длины цитоофидий вручную подсчитывали более 200 клеток для каждого штамма в каждом из трех биологических повторов.Результаты экспериментов обрабатывались функцией ANOVA программы GraphPad Prism. * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001.

41″> Доступность данных

Штаммы и плазмиды доступны по запросу. Авторы утверждают, что все данные, необходимые для подтверждения выводов статьи, присутствуют в статье, рисунках и таблицах.

44″> Сравнение цитоофидий Ura7 и Asn1

В нашем предыдущем исследовании мы наблюдали, что в большинстве клеток цитоофидии Ura7 и цитоофидии Asn1 перекрываются в середине или на концах (Zhang et al. 2018). Для дальнейшего изучения мы создали штамм с двойной меткой Ura7-GFP Asn1-mCherry. Клетки этого штамма собирали в трех фазах роста: экспоненциальной фазе, диуксусной фазе и стационарной фазе (рис. 1А).Паттерн образования цитоофидия этими двумя метаболическими ферментами в целом схож. По мере роста клеток количество цитоофидий Asn1 и Ura7 постепенно увеличивается и достигает пика в стационарной фазе (Figure 1B). В экспоненциальной фазе наблюдались точечные цитоофидии Ura7. Однако есть различия: Ura7 начинает формировать цитоофидии в экспоненциальной фазе, а для Asn1 — в диауксической фазе (Рис. 1, A и B). Цитофидии Ura7 изогнуты, а цитоофидии Asn1 короткие и стержневидные в стационарной фазе (Figure 1B).Результаты количественной оценки длины показали, что средняя длина цитоофидий Ura7 и цитоофидий Asn1 составляет 1,6 мкм и 0,6 мкм соответственно.

Рисунок 1

Цитофидии Ura7 и Asn1 в S. cerevisiae . Клетки Ura7-GFP Asn1-mCherry выращивали в богатой среде, и клетки собирали через 6, 24 и 168 часов культивирования. Затем клетки фиксировали 4% PFA при комнатной температуре в течение 10 мин. Белки Ura7-GFP и Asn1-mCherry наблюдались с помощью флуоресцентной микроскопии.Рассчитывали численность цитоплазматических цитоофидий и строили график средней длины цитоплазматических цитоофидий. (A) Репрезентативное конфокальное изображение клеток Ura7-GFP Asn1-mCherry. Цитофидии Ura7 наблюдались во всех трех фазах роста. Шкала 5 мкм. (B) Количественный анализ клеток с видимыми цитоофидиями был нанесен на график и выражен как процент клеток, содержащих цитоофидии, в трех фазах роста. * P <0,05 и *** P <0,001 (C) Средняя длина цитоофидий Ura7 и Asn1 была измерена и нанесена на график в стационарной фазе.

Рисунок 1

цитоофидии Ura7 и Asn1 в S. cerevisiae . Клетки Ura7-GFP Asn1-mCherry выращивали в богатой среде, и клетки собирали через 6, 24 и 168 часов культивирования. Затем клетки фиксировали 4% PFA при комнатной температуре в течение 10 мин. Белки Ura7-GFP и Asn1-mCherry наблюдались с помощью флуоресцентной микроскопии. Рассчитывали численность цитоплазматических цитоофидий и строили график средней длины цитоплазматических цитоофидий. (A) Репрезентативное конфокальное изображение клеток Ura7-GFP Asn1-mCherry.Цитофидии Ura7 наблюдались во всех трех фазах роста. Шкала 5 мкм. (B) Количественный анализ клеток с видимыми цитоофидиями был нанесен на график и выражен как процент клеток, содержащих цитоофидии, в трех фазах роста. * P <0,05 и *** P <0,001 (C) Средняя длина цитоофидий Ura7 и Asn1 была измерена и нанесена на график в стационарной фазе.

50″> Нокаут Ura7 не оказывает очевидного влияния на цитоофидию Asn1

Чтобы ответить на вопрос, влияет ли на длину цитоофидия Asn1 нарушение Ura7, мы сконструировали клетки Asn1-GFP Ura7 и использовали клетки Asn1-GFP в качестве контрольного штамма. Мы собрали клетки в стационарной фазе (рис. 3A) и проанализировали влияние делеции Ura7 на численность, длину и уровень белка Asn1 cytoophidium.Результаты количественной оценки показывают, что нокаут Ura7 не влиял на численность цитоофидий Asn1 во время трех фаз роста (рис. 3В). Средняя длина цитоофидий Asn1 без и с нокаутом Ura7 существенно не различалась, составляя, соответственно, 0,60 и 0,57 мкм (рис. 3C). Между тем, уровень белка Asn1 в двух клеточных штаммах был аналогичным (рис. 3, D и E). Взятые вместе, эти результаты показывают, что цитоофидии Asn1 и Ura7 имеют разные эффекты друг на друга.

Рисунок 3

Влияние разрушения Ura7 на цитоофидии Asn1.Клетки, выращенные в богатой среде, собирали в течение трех фаз роста и наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. (A) Репрезентативные конфокальные изображения штаммов ASN1-GFP И ASN1-GFP URA7 △ в стационарной фазе. Шкала 5 мкм. (B) Обилие Cytoophidium в клетках Asn1-GFP нанесено на график вместе с количеством цитоофидий в клетках с нокаутом URA7 . (C) Измерение длины цитоофидия Asn1 без и с делецией URA7 в стационарной фазе. (D) Вестерн-блот-анализ уровня белка Asn1 в штаммах ASN1-GFP И ASN1-GFP URA7 в стационарной фазе.(E) Уровни белка были нанесены на график после нормализации уровней альфа-актина, и уровень белка Asn1 в клетках Asn1-GFP обозначен как 1.

Рисунок 3

Влияние разрушения Ura7 на цитоофидии Asn1. Клетки, выращенные в богатой среде, собирали в течение трех фаз роста и наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. (A) Репрезентативные конфокальные изображения штаммов ASN1-GFP И ASN1-GFP URA7 △ в стационарной фазе. Шкала 5 мкм. (B) Обилие Cytoophidium в клетках Asn1-GFP нанесено на график вместе с количеством цитоофидий в клетках с нокаутом URA7 .(C) Измерение длины цитоофидия Asn1 без и с делецией URA7 в стационарной фазе. (D) Вестерн-блот-анализ уровня белка Asn1 в штаммах ASN1-GFP И ASN1-GFP URA7 в стационарной фазе. (E) Уровни белка были нанесены на график после нормализации уровней альфа-актина, и уровень белка Asn1 в клетках Asn1-GFP обозначен как 1.

58″> Индукция цитоофидий Ura7 и Asn1

Численность цитоофидиев

Ura7 и Asn1 достигла пика в стационарной фазе.Мы задались вопросом, может ли использование культуральной среды стационарной фазы индуцировать образование цитоофидия в двух других фазах роста. Сначала мы собрали культуральную среду стационарной фазы, в которой клетки росли в течение одной недели, и использовали ее для замены культуральной среды экспоненциальной и диауксической фаз клеток в течение 4 часов. В фазе экспоненциального роста дрожжевые клетки используют глюкозу в качестве источника углерода для производства этанола. Когда уровень глюкозы ограничен, клетки начинают использовать доступный этанол в качестве источника энергии и переходят в диуксиновую фазу.В стационарной фазе деления клеток не происходит, и рост дрожжей выходит на плато.

Согласно результатам количественной оценки, переход к культуральной среде стационарной фазы значительно увеличил образование цитоофидия Ura7 и Asn1 в экспоненциальной фазе (рис. 5A), с 59,23% до 80,94% для Ura7 и от 0% до 22,08% для Asn1. К нашему удивлению, цитоофидии Ura7 и Asn1 в диауксической фазе не подвергались влиянию этого сдвига культуральной среды (Рисунок 5B).

Рисунок 5

Влияние культуральной среды стационарной фазы на цитоофидии Ura7 и Asn1 в экспоненциальной и диауксической фазах.Культуральную среду стационарной фазы собирали через 168 ч культивирования. Клетки выращивали в богатой среде до экспоненциальной и диуксической фазы. Среду заменяли культуральной средой со стационарной фазой, когда клетки находились в экспоненциальной фазе и диауксической фазе в течение 2 часов. (A) Количественная оценка численности цитоофидия Ura7 и Asn1 перед сдвигом среды в экспоненциальную фазу вместе с клетками, выросшими без обработки и при сдвиге среды. (B) Тот же анализ, что и в A, был проведен в диуксусной фазе. ** P <0.01.

Рисунок 5

Влияние культуральной среды стационарной фазы на цитоофидии Ura7 и Asn1 в экспоненциальной и диауксической фазах. Культуральную среду стационарной фазы собирали через 168 ч культивирования. Клетки выращивали в богатой среде до экспоненциальной и диуксической фазы. Среду заменяли культуральной средой со стационарной фазой, когда клетки находились в экспоненциальной фазе и диауксической фазе в течение 2 часов. (A) Количественная оценка численности цитоофидия Ura7 и Asn1 перед сдвигом среды в экспоненциальную фазу вместе с клетками, выросшими без обработки и при сдвиге среды.(B) Тот же анализ, что и в A, был проведен в диуксусной фазе. ** P <0,01.

65″> Аналог глутамина подавляет образование цитоофидия ASNS

И CTPS, и ASNS используют глутамин в качестве донора азота.Чтобы изучить регуляцию метаболизма глутамина при формировании цитоофидий ASNS, мы использовали аналог глутамина DON в различных концентрациях для обработки клеток ASN1-GFP ASN2-mcherry. Статистические результаты показали, что на формирование цитоофидий ASNS влияло увеличение концентрации ДОН (рис. 7). Цитофидии ASN1 и ASN2 можно было наблюдать более чем в 60% клеток без ДОН, а их средняя длина составляла около 1,2 мкм. Когда содержание ДОН составляло 2%, численность цитоофидий составляла около 53%, а средняя длина составляла всего около 1 мкм.Когда концентрация ДОН была увеличена до 4%, численность цитоофидий была менее 50%, а средняя длина была менее 1 мкМ. Эти результаты позволяют предположить, что ДОН отрицательно влияет на формирование цитоофидий ASNS.

Рисунок 7

Аналог глутамина подавляет образование цитоофидия ASNS. (A – C) ASN1-GFP Клетки ASN2-mcherry, обработанные 6-диазо-5-оксо-L-норлейцином (ДОН) с концентрациями 0%, 2% и 4% соответственно. (D – F) Цитофидия ASN1-GFP в клетках ASN1-GFP ASN2-mcherry, обработанных ДОН в различных концентрациях.(G – I) Цитофидия ASN2-mcherry в клетках ASN1-GFP ASN2-mcherry, обработанных ДОН в различных концентрациях. (J – L) ДНК в клетках ASN1-GFP ASN2-mcherry, обработанных ДОН. (M) Обилие клеток цитоофидии ASN1-GFP ASN2-mcherry, обработанных ДОН. (N) Средняя длина цитоофидий в клетках ASN1-GFP и ASN2-mcherry, обработанных ДОН. Результаты экспериментов обрабатывались функцией ANOVA программы GraphPad Prism. * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001.

Рисунок 7

Аналог глутамина подавляет образование цитоофидия ASNS. (A – C) ASN1-GFP Клетки ASN2-mcherry, обработанные 6-диазо-5-оксо-L-норлейцином (ДОН) с концентрациями 0%, 2% и 4% соответственно. (D – F) Цитофидия ASN1-GFP в клетках ASN1-GFP ASN2-mcherry, обработанных ДОН в различных концентрациях. (G – I) Цитофидия ASN2-mcherry в клетках ASN1-GFP ASN2-mcherry, обработанных ДОН в различных концентрациях. (J – L) ДНК в клетках ASN1-GFP ASN2-mcherry, обработанных ДОН. (M) Обилие клеток цитоофидии ASN1-GFP ASN2-mcherry, обработанных ДОН.(N) Средняя длина цитоофидий в клетках ASN1-GFP и ASN2-mcherry, обработанных ДОН. Результаты экспериментов обрабатывались функцией ANOVA программы GraphPad Prism. * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001.

74″ data-legacy-id=»ack1″> Благодарности

Мы благодарны профессору Цзиньцю Чжоу и его сотрудникам лаборатории Шанхайского института биохимии и клеточной биологии (SIBCB) Китайской академии наук (CAS) за их помощь. Мы благодарим сотрудников лаборатории Лю, особенно И-Лан Ли, за обсуждение. Мы благодарим Центр молекулярной визуализации (MICF) и Центр молекулярной и клеточной биологии (MCBCF) в Школе естественных наук и технологий Шанхайского технологического университета за оказанную техническую поддержку.

79″ data-legacy-id=»ref1″> Цитированная литература

Andreadis

Hulme

Венсли

Лю

JL.

2019

Путь TOR модулирует образование цитоофидия в Schizosaccharomyces pombe

Дж. Биол. Хим.

294

14686

—

14703

Огей

Грайс

Лю

JL.

2016

Взаимодействие между Myc и CTP-синтазой у Drosophila

PLoS Genet

e1005867

Огей

Грайс

Шэнь

Чанг

, и другие.

2014

Синтез нуклеотидов регулируется образованием цитоофидия во время развития нервной системы и адаптивного метаболизма

Biol Open

1045

—

1056

Огей

Лю

JL.

2016

Регуляция метаболизма посредством ферментативной филаментации

Crit Rev Biochem Mol Biol

282

—

293

Аззам

Лю

JL.

2013

Только одна изоформа Drosophila melanogaster CTP-синтазы образует цитоофидий

PLoS Genet

e1003256

Барри

Битбол

Лорестани

Чарльз

Habrian

, и другие.

2014

Крупномасштабное образование филаментов подавляет активность CTP-синтетазы

Элиф

e03638

Чанг

Йенг

Пэн

Кеппеке

Сун

, и другие.

2017

CTP-синтаза образует цитоофидий в гепатоцеллюлярной карциноме человека

Exp Cell Res

361

292

—

299

Чанг

Кеппеке

Сун

Лю

JL.

2018

Межфиламентное взаимодействие между IMPDH и цитоофидиями CTPS

FEBS J

285

3753

—

3768

Чанг

Лин

Пай

Ли

, и другие.

2015

Сборка Cytoophidium отражает повышенную регуляцию активности IMPDH

J Cell Sci

128

3550

—

3555

Чен

Чжан

Дж

Тастан

Деуссен

Siswick

, и другие.

2011

Аналоги глутамина способствуют сборке цитоофидия в клетках человека и дрозофилы

Дж. Генет Геномика

391

—

402

Dang

Валенс

Болотин-Фукухара

Daignan-Fornier

1996

Клонирование генов ASN1 и ASN2, кодирующих аспарагинсинтетазы, в Saccharomyces cerevisiae : дифференциальная регуляция с помощью фактора связывания CCAAT-бокса

Мол микробиол

681

—

692

Дауман

Hickl

Циммер

ДеТар

РА

Кунц

, и другие.

2018

Характеристика филамент-образующих CTP-синтаз Arabidopsis thaliana

Завод J

316

—

328

Gou

км

Чанг

Шэнь

Сун

Лю

JL.

2014

CTP-синтаза образует цитоофидии в цитоплазме и ядре

Exp Cell Res

323

242

—

253

Хуан

Ван

Ghosh

Лю

JL.

2017

Критические роли N-конца CTP-синтазы в сборке цитоофидия

Exp Cell Res

354

122

—

133

Умбер

Симони

РД.

1980

Генетические и биомедицинские исследования, демонстрирующие второй ген, кодирующий аспарагинсинтетазу, в Escherichia coli

Дж Бактериол

142

212

—

220

Ингерсон-Махар

Бригель

Вернер

Дженсен

Gitai

2010

Метаболический фермент CTP-синтаза образует филаменты цитоскелета

Nat Cell Biol

739

—

746

Джонс

GE.

1978

Ауксотрофы L-аспарагина Saccharomyces cerevisiae : генетическая и фенотипическая характеристика

Дж Бактериол

134

200

—

207

Ren

Ван

ПЯ

Ду

ЛЛ

, и другие.

2018

Активный транспорт цитоофидий у Schizosaccharomyces pombe

FASEB J

5891

—

5898

Лю

JL.

2020

Гипоосмоляльность нарушает целостность цитоофидия во время азотного голодания

Дрожжи.

DOI: 10.1002 / yea.3542. Epub впереди печати; PMID: 33294993

Лю

J-L.

2010

Внутриклеточная компартментация CTP-синтазы у Drosophila

Дж. Генет Геномика

281

—

296

Лю

JL.

2011

Загадочный цитоофидий: компартментация CTP-синтазы посредством образования филаментов

Биологические исследования

159

—

164

Лю

JL.

2016

Cytoophidium и его виды: филаментация и компартментация метаболических ферментов

Annu Rev Cell Dev Biol

349

—

372

Линч

Хикс

Пастух

Endrizzi

Производитель

, и другие.

2017

Структура филаментов CTP-синтазы человека выявляет конформацию активного фермента

Нат Структ Мол Биол

507

—

514

Линч

Kollman

JM.

2020

Спаренные структурные переходы делают возможной высоко кооперативную регуляцию филаментов CTPS2 человека

Нат Структ Мол Биол

—

Надкарни

McDonough

Ян

Stukey

Озье-Калогеропулос

, и другие.

1995

Дифференциальная биохимическая регуляция кодируемых URA7 и URA8 CTP синтетаз из Saccharomyces cerevisiae

Дж. Биол. Хим.

270

24982

—

24988

Noree

Бегович

Самило

Broyer

Монфорт

, и другие.

2019a

Количественный анализ структур метаболических ферментов выявляет закономерности сборки в метаболической сети дрожжей

Ячейка Mol Biol

2721

—

2736

Noree

Сато

Broyer

Wilhelm

JE.

2010

Идентификация новых филамент-образующих белков у Saccharomyces cerevisiae и Drosophila melanogaster

Дж. Ячейка Биол

190

541

—

551

Noree

Sirinonthanawech

Wilhelm

JE.

2019b

Saccharomyces cerevisiae ASN1 и ASN2 представляют собой паралоги аспарагинсинтетазы, которые различаются по своей способности полимеризоваться в ответ на стресс, связанный с питательными веществами

Научный руководитель

278

Озье-Калогеропулос

Аделина

Ян

Carman

Lacroute

1994

Использование синтетических летальных мутантов для клонирования и характеристики нового гена CTP-синтетазы в Saccharomyces cerevisiae

Мол Генет

242

431

—

439

Рамос

Wiame

JM.

1980

Две аспарагинсинтетазы в Saccharomyces cerevisiae

евро J Biochem

108

373

—

377

Шен

Кассим

Хуан

Чжан

Дж

, и другие.

2016

Филаментация метаболических ферментов в Saccharomyces cerevisiae

Дж. Генет Геномика

393

—

404

Вс

Лю

JL.

2019a

Формирование цитоофидий продлевает период полужизни CTP-синтазы

Ячейка Discov

Вс

Лю

JL.

2019b

Путь mTOR-S6K1 опосредует сборку цитоофидия

Дж. Генет Геномика

—

Тастан

Лю

JL.

2015

CTP-синтаза необходима для гомеостаза зрительной доли у Drosophila

Дж. Генет Геномика

261

—

274

Лю

JL.

2019

Cytoophidia реагирует на стресс, связанный с питанием, у Drosophila

Exp Cell Res

376

159

—

167

Чжан

Тастан

Чжоу

Guo

Лю

, и другие.

2020a

Фермент синтеза пролина P5CS образует цитоофидии у Drosophila

Дж. Генет Геномика

131

—

143

Чжан

Дж

Hulme

Лю

JL.

2014

Асимметричное наследование цитоофидий у Schizosaccharomyces pombe

Biol Open

1092

—

1097

Чжан

Дж

Лю

JL.

2019

Термочувствительная сборка цитоофидия в Schizosaccharomyces pombe

Дж. Генет Геномика

423

—

432

Чжан

Ding

Шэнь

Чжао

Лю

JL.

2018

Филаментация аспарагинсинтетазы в Saccharomyces cerevisiae

PLoS Genet

e1007737

Чжан

Лю

JL.

2021

Долгосрочная визуализация и динамический анализ Cytoophidia дрожжей

Методы Мол Биол

2196

235

—

244

Чжан

Лю

Дж

Лю

JL.

2020b

Атлас цитоофидий личинок дрозофилы

Дж. Генет Геномика

321

—

331

Чжоу

Сян

Лю

JL.

2020

CTP-синтаза образует цитоофидии архей

Дж. Генет Геномика

213

—

223

Чжоу

Guo

Чжун

Дж

Вс

, и другие.

2019

CTP-синтаза дрозофилы может образовывать отдельные филаменты, связанные с субстратом и продуктом

Дж. Генет Геномика

537

—

545

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0 /), что разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

CTP и DCI: нам нужны разъяснения

Работа Мерфи и соавт. «Изменения перфузии головного мозга при индуцированной гипертензии при аневризматическом субарахноидальном кровоизлиянии: экспериментальное и технико-экономическое обоснование».[1] представляет собой ретроспективное исследование применимости перфузии при компьютерной томографии (CTP) до и после лечения отсроченной клинической ишемии (DCI) через индуцированную гипертензию (IH). Эта работа основана на обширной истории лечения DCI с использованием «тройной H-терапии» с применением эффективного и широко доступного метода измерения мозгового кровотока. Литература, рассмотренная в этой статье, отражает текущий конфликт в отношении лечения DCI: а именно, DCI связана с худшими результатами после субарахноидального кровоизлияния (SAH), но лечение DCI не показало улучшения результатов.

Это исследование представляет собой прагматический ретроспективный взгляд на реальную службу SAH. Пациенты получали CTP вскоре после прибытия, а затем снова в период, когда наиболее вероятно появление DCI. Из трех измерений, полученных в CTP, наиболее полезным является среднее время прохождения (MTT). Фактически, существует прогностический эффект пролонгированного МТТ на раннее CTP для более позднего DCI. В группе DCI MTT значительно снижается после учреждения IH. Однако не было никакой разницы в инфаркте или неблагоприятном исходе по сравнению с группой, в которой не развился DCI.

Терапия «тройной Н» для лечения DCI включает гиперволемию, гипертензию и гемодилюцию. Растущее признание осложнений от терапии «тройным Н» привело к новой оценке роли каждого из трех компонентов. В результате 2 из 3 «H» потеряли значение, оставив индуцированную гипертензию в качестве основы лечения DCI [2]. Терапия «Triple H» оценивалась и как лечение, и как профилактика DCI, но без единого мнения [3]. Настоящая статья посвящена этому центральному вопросу.По замыслу, IH в этой статье — это «лечение» клинической DCI. Однако обнаружение раннего удлинения МТТ задолго до развития симптомов повышает вероятность того, что IH может играть роль в «профилактике» DCI, а также в лечении. Возможно, артериальная гипертензия играет определенную роль сразу после того, как аневризма зафиксирована, и ее можно оценить с помощью CTP.

Хотя DCI является ведущей причиной смерти и инвалидности при лечении аневризматической САК, использование «тройного H» не обязательно дает лучшие результаты.Неясно, что именно меняется в физиологии аневризматической САК при «лечении» DCI. Интуитивно кажется, что это изменение мозгового кровотока (CBF). Многие методы, включая ПЭТ, ОФЭКТ, МРТ, а теперь и КТР, пытались идентифицировать эту сигнатуру [4]. CTP, с его практическими преимуществами, заключающимися в широкой доступности и быстром приобретении, в последнее время привлекает больше внимания со смешанными результатами [5, 6]. Мерфи и др. указывают, что CBF может быть неправильной подписью. Похоже, что MTT, а не CBF, является ключевым компонентом как для выявления тех, кто с большей вероятностью разовьет DCI, так и для мониторинга эффекта лечения.Авторам удалось продемонстрировать значительное изменение при использовании МТТ у одной десятой пациентов, которые считались необходимыми для исследования ИГ, если кто-то ищет изменения в CBF [7].

В этой статье, как и в других, не было обнаружено клинических различий в когортах DCI и не-DCI. Это может быть просто потому, что IH улучшил результаты в когорте DCI по сравнению с когортой без DCI. Авторы заявляют, что рандомизация пациентов с DCI на лечение IH неэтична в их учреждении. Они также приводят все больше доказательств как вреда, так и отсутствия клинической эффективности текущей терапии DCI.Следовательно, клиницисты этически обязаны объективно оценивать лечение (или профилактику) DCI, как и любую другую терапию. Рандомизированное исследование (HIMALAIA) для оценки IH при DCI недавно завершилось из-за отсутствия набора, но это не должно быть последним словом по теме [8]. Я надеюсь, что эта статья с ее результатами МТТ как чувствительной меры как для отбора пациентов, так и для оценки терапевтического ответа послужит вдохновением для дальнейшего изучения этого вопроса.

Ссылки

1.
Мерфи А., де Оливейра Маноэль А.Л., Макдональд Р.Л. и др. Изменения церебральной перфузии при индуцированной гипертензии при аневризматическом субарахноидальном кровоизлиянии: экспериментальное и технико-экономическое обоснование. Neurocrit Care. 2017 ;. DOI: 10.1007 / s12028-017-0379-6.
PubMed
Google Scholar
2.
Treggiari MM, Deem S. Какой H является наиболее важным в терапии тройным H при церебральном вазоспазме? Curr Opin Crit Care. 2009. 15 (2): 83–6.
Артикул
PubMed
Google Scholar
3.
Dankbaar JW, Slooter AJ, Rinkel GJ и др. Влияние различных компонентов терапии Triple-H на перфузию головного мозга у пациентов с аневризматическим субарахноидальным кровоизлиянием: систематический обзор. Crit Care. 2010; 14: R23.
Артикул
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
4.
Keyrouz SG, Diringer MN. Клинический обзор: профилактика и терапия спазма сосудов при субарахноидальном кровоизлиянии. Crit Care. 2007; 11: 220.
Артикул
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
5.
Мир Д.И., Гупта А., Даннинг А. и др. КТ-перфузия для обнаружения отсроченной ишемии головного мозга при аневризматическом субарахноидальном кровоизлиянии: систематический обзор и метаанализ. AJNR Am J Neuroradiol. 2014; 35: 866–71.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
6.
Cremers CH, van der Schaaf IC, Wensink E, et al. КТ-перфузия и отсроченная церебральная ишемия при аневризматическом субарахноидальном кровоизлиянии: систематический обзор и метаанализ.J Cereb Blood Flow Metab. 2014; 34: 200–7.
Артикул
PubMed
Google Scholar
7.
Gathier CS, Dankbaar JW, van der Jagt M, et al. Влияние индуцированной гипертензии на перфузию головного мозга при отсроченной ишемии головного мозга после аневризматического субарахноидального кровоизлияния: рандомизированное клиническое исследование. Инсульт. 2015; 46: 327–81.
Артикул
Google Scholar
8.
Gathier CS, van den Bergh WM, Slooter AJ, et al.ГИМАЛАЯ (индукция гипертензии при лечении аневризмы субарахноидального кровотечения с вторичной ишемией A): рандомизированное слепое контролируемое исследование индуцированной гипертензии по сравнению с отсутствием индуцированной гипертензии при лечении отсроченной ишемии головного мозга. Int J Stroke. 2014; 9: 375–80.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar

Скачать ссылки

Информация об авторе

Принадлежности

Neurosurgical Associates, Больница Джонстон Уиллис, Ричмонд, штат Вирджиния, США
Томас Маттингли

Автор корреспонденции

Для корреспонденции
Томас Маттингли.

Об этой статье

Цитируйте эту статью

Маттингли, T. CTP и DCI: нам нужны разъяснения.
Neurocrit Care 27, 1-2 (2017). https://doi.org/10.1007/s12028-017-0434-3

Скачать цитату

Blog Detail